雖然癌癥傳統上通過化學療法、放射療法、靶向療法和手術進行治療，但癌癥治療的第五支柱免疫療法在最近幾年中出現，并徹底改變了對癌癥的戰爭。免疫治療藥物的基準(benchmark)由t細胞檢查點(ctla-4和pd1/pd-l1)抑制劑的開發建立。已經展示出，這些療法有效地擴大和重新活化腫瘤特異性t細胞的庫(pool)，導致患有某些癌癥的患者的高達50％的客觀響應率。白介素2(il-2)是首次描述的針對t細胞的生長因子。il-2在體內擴增淋巴細胞群體并增加這些細胞的效應功能的能力賦予il-2抗腫瘤作用，并導致批準高劑量重組il-2用于某些轉移性癌癥。雖然il-2癌癥免疫療法在大約10％的患者中顯示出持久的響應，但il-2癌癥免疫療法與多于一種問題相關，包括由誘導血管滲漏綜合征(vls)引起的嚴重毒性、由誘導活化誘導的細胞死亡(aicd)引起的腫瘤耐受性和由treg細胞活化引起的免疫抑制。已經采取了若干方法來克服il-2免疫療法中固有的挑戰。抗衡全身毒性的一種這樣的方法涉及通過腫瘤靶向il-2免疫細胞因子將細胞因子活性定位于癌細胞及其周圍組織，所述腫瘤靶向il-2免疫細胞因子通過il-2與腫瘤相關抗原特異性的抗體的融合而構建。然而，這種策略缺乏特異性靶向腫瘤微環境(tme)內的與抗癌免疫相關的效應t細胞的能力。腫瘤內t細胞靶向方面的這一空白可以通過將il-2與抗程序性細胞死亡蛋白1(pd1)抗體融合來填補。pd1(也稱為cd279)在腫瘤浸潤性淋巴細胞(til)上高表達，并且pd1抗體il-2免疫細胞因子使il-2能夠直接靶向til。它展示出對腫瘤內cd8+t細胞而不是treg細胞或外周cd4+和cd8+t細胞的升高的親和力。因此，該策略進一步改善了il-2抗癌免疫，同時降低了全身毒性。除了將il-2直接靶向til以改善il-2抗癌免疫之外，能夠阻斷pd1并逆轉t細胞無反應性或耗盡的pd1抗體可以與il-2協同作用，進一步加強il-2的抗癌免疫應答。因此，期望構建具有優越的靶結合和pd1阻斷能力的pd1抗體的pd1?ab-il-2免疫細胞因子。在全球市售的各種pd1阻斷抗體中，從根本上改變了癌癥免疫治療的領域的帕博利珠單抗(pembrolizumab)(merck?sharp&dohme?corp.)因其高有效性和批準用于治療很多種癌癥類型而受到了極大的關注。雖然帕博利珠單抗表現出優越的靶結合和阻斷能力，但它具有幾種序列缺陷，包括可能引起免疫原性問題的相對低程度的人源性(humanness)和傾向于增加其聚集傾向的高疏水性。因此，優選優化帕博利珠單抗以減輕其序列缺陷，同時完全保持它的生物活性。所得優化序列預期改善pd1?ab-il-2融合蛋白的可開發性。重要的是，pd1?ab與完全活性的il-2部分的融合可以壓倒意圖的抗體介導的靶向，使融合蛋白定位至外周中表達il-2受體的細胞而不是腫瘤中的til。因此，為了改善靶特異性和選擇性，一種方法是使用具有減弱的il-2rβγ活性的il-2部分來制備融合體，以在細胞因子和抗體組分之間建立化學計量平衡。另外，降低細胞因子效力可以潛在地減輕途徑過度活化以及減輕抗原沉沒(antigen?sink)和靶介導的沉積。改善靶特異性和選擇性的另一相關但更復雜的策略是應用由本發明人在wo2019246392和wo2021119516中公開的vitokine平臺。在vitokine構建體中，il-2部分的活性將保持惰性或最小，直到被腫瘤中或腫瘤周圍上調的蛋白酶局部激活。通過這樣做，可以顯著限制il-2部分與其在非患病細胞的外周中或細胞表面上的受體的結合。這可以幫助防止途徑過度活化并減少不期望的“組織外”“中靶”(“on-target”“off?tissue”)毒性，并且vitokine的改善的安全性譜可以允許pd1抗體的有效范圍內的人類劑量水平。另外，在蛋白酶活化之前，il-2部分的惰性將顯著降低潛在的抗原沉沒或靶沉沒，并從而延長體內半衰期且導致改進的在意圖治療部位處的生物分布和生物可利用度。發明的公開內容在一方面，本發明提供了一種新的pd1靶向性可生物活化的il-2免疫細胞因子(本文稱為pd1?ab-il-2?vitokine)，其旨在將可生物活化的il-2直接靶向腫瘤浸潤性淋巴細胞。il-2部分的活性將保持幾乎惰性或最小，直到被腫瘤中上調的蛋白酶局部激活，這將限制il-2部分與其非患病細胞或正常組織的外周中或細胞表面上的受體的結合。這可以幫助防止途徑過度活化，減少不期望的“組織外”“中靶”毒性，并使不期望的靶沉沒最小化。在另一方面，本發明提供了旨在將活性調節的il-2結構域直接靶向腫瘤浸潤性淋巴細胞的新的pd1靶向性il-2免疫細胞因子。預期減弱的il-2活性利于在細胞因子和抗體臂之間建立化學計量平衡，有助于減輕途徑過度活化，并減輕抗原沉沒和靶介導的沉積。該策略特異性靶向腫瘤微環境(tme)內與抗癌免疫相關的效應t細胞。通過實施該策略，il-2擴增淋巴細胞群體并增強其效應功能的能力與pd1阻斷抗體在逆轉t細胞無反應性或耗盡中的功能協同作用。這種方法，特別是當使用效力減弱的或可生物活化的il-2時，降低了基于全身性機制的毒性，導致il-2用于癌癥治療的更廣泛的治療用途，并改善了在預期治療部位處的生物分布和生物可利用度。在各種實施方案中，pd1靶向性可生物活化的il-2免疫細胞因子在本文中被稱為pd1ab-il-2?vitokine。在各種實施方案中，由本發明人在wo2019246392和wo2021119516中公開的vitokine平臺由如圖1中所描繪的構建體和如圖2中所描繪的提出的活化方法之一定義。在各種實施方案中，本發明的pd1?ab-il-2?vitokine更具體地由圖3a中所圖示出的構建體限定。參考圖3a，本發明的pd1?ab-il-2?vitokine包含pd1阻斷抗體、單價il-2結構域(活性部分結構域)，其n末端經由l1接頭與pd1抗體的異源二聚體fc鏈的c末端融合，并且其c末端經由l2接頭與il-2rαsushi結構域(遮蔽部分結構域)的n末端融合。在各種實施方案中，通過將種系序列取代引入cdr殘基、將種系序列取代引入框架體細胞突變和/或采用最普遍且表現更好的vh3人類種系家族序列作為受體框架，從帕博利珠單抗的可變結構域優化本發明的pd1阻斷抗體的可變結構域。在各種實施方案中，pd1阻斷抗體對于如seq?id?no:1中列出的人類pd1蛋白具有高親和力，以與帕博利珠單抗相等或相當的效力起抑制pd1的作用，表現出比帕博利珠單抗更高的與其最接近的人類種系序列的序列相似性評分，從而指示提高的人源性程度，并且預測具有比帕博利珠單抗更低的疏水性，這進而降低其聚集傾向。在各種實施方案中，pd1阻斷抗體包含具有seq?id?no:3中列出的序列的輕鏈可變區和具有seq?id?no:7中列出的序列的重鏈可變區。在各種實施方案中，pd1阻斷抗體包含具有seq?id?no:3中列出的序列的輕鏈可變區和具有seq?id?no:9中列出的序列的重鏈可變區。在各種實施方案中，pd1阻斷抗體包含具有seq?id?no:3中列出的序列的輕鏈可變區和具有seq?id?no:11中列出的序列的重鏈可變區。在各種實施方案中，pd1阻斷抗體包含具有seq?id?no:3中列出的序列的輕鏈可變區和具有seq?id?no:13中列出的序列的重鏈可變區。在各種實施方案中，pd1阻斷抗體包含具有seq?id?no:3中列出的序列的輕鏈可變區和具有seq?id?no:18中列出的序列的重鏈可變區。在各種實施方案中，pd1靶向性il-2免疫細胞因子由如圖3b中描繪的構建體限定。在各種實施方案中，pd1靶向性il-2免疫細胞因子的效力調節的il-2是il-2變體(或突變體)，其包含源自成熟人類il-2多肽(在本文中也稱為huil-12或il-2野生型(w/t))，如seqid?no:116中列出的包含一個或更多個氨基酸取代、缺失或插入的序列。在各種實施方案中，氨基酸變化是seq?id?no:116的位置19、65、125或126處的一個或更多個氨基酸取代。在各種實施方案中，氨基酸變化是成熟人類il-2序列在位置19處的l至d或h或n或p或q或r或s或y、在位置65處的p至g或e或h或r或a或k或n或q、在位置125處的c至i、在位置126處的q至a或d或e或f或g或h或i或k或l或m或n或p或r或s或t或v或w或y的取代，或這些取代的任何組合。在各種實施方案中，與天然il-2多肽相比，il-2變體具有減少/消除的與il-2rα的結合。在各種實施方案中，與天然il-2多肽相比，il-2變體具有降低的對il-2rβγ受體的結合活性。在各種實施方案中，與天然il-2多肽相比，il-2變體具有減少/消除的與il-2rα結合和調節的對il-2rβγ受體的結合活性。在各種實施方案中，il-2變體選自seq?id?no:117-180中列出的序列的組。在各種實施方案中，pd1?ab-il-2?vitokine的活性部分是包含如seq?id?no:116中列出的成熟人類il-2多肽的序列的il-2結構域。在各種實施方案中，il-2結構域是il-2變體(或突變體)，其包含源自如seq?id?no:116中列出的成熟人類il-2多肽的包含一個或更多個氨基酸取代、缺失或插入的序列的序列。在各種實施方案中，氨基酸變化是seq?idno:116的位置19、65、125或126處的一個或更多個氨基酸取代。在各種實施方案中，氨基酸變化是成熟人類il-2序列在位置19處的l至d或h或n或p或q或r或s或y、在位置65處的p至g或e或h或r或a或k或n或q、在位置125處的c至i、在位置126處的q至a或d或e或f或g或h或i或k或l或m或n或p或r或s或t或v或w或y的取代，或這些取代的任何組合。在各種實施方案中，vitokine構建體將包含設計為具有減少/消除的與il-2rα結合的il-2部分。在各種實施方案中，與天然il-2多肽相比，il-2變體具有降低的對il-2rβγ的結合活性。在各種實施方案中，與天然il-2多肽相比，il-2變體具有減少/消除的與il-2rα結合和改變的對il-2rβγ的結合活性。在各種實施方案中，vitokine構建體中的il-2變體可以調節il-2?vitokine固有基礎活性以實現最佳抗腫瘤功效，同時最小化不期望的全身毒性以擴大治療窗口。在各種實施方案中，il-2結構域選自seq?id?no:117-180中列出的序列的組。在各種實施方案中，遮蔽部分結構域是同源受體/結合配偶體，或針對il-2鑒定的任何結合配偶體。在各種實施方案中，遮蔽部分結構域是具有seq?id?no:181中列出的序列的il-2rα細胞外結構域或其功能片段。在各種實施方案中，il-2rα細胞外結構域或其功能片段是具有seq?id?no:182中列出的序列的il-2rαsushi結構域。在各種實施方案中，遮蔽部分結構域是il-2rαsushi結構域的變體(突變體)。在各種實施方案中，氨基酸變化是seqid?no:182的位置36、38、42或43處的一個或更多個氨基酸取代。在各種實施方案中，氨基酸變化是在位置36處的r至a取代，在位置38處的k至e取代，在位置42處的l至g取代，在位置43處的y至a取代。在各種實施方案中，il-2rαsushi結構域的變體(突變體)被設計成在蛋白水解裂解后有利于解離和擴散。在各種實施方案中，il-2rαsushi結構域的變體(突變體)選自seq?id?no:183-185中列出的序列的組。在各種實施方案中，pd1?ab-il-2?vitokine構建體的l1接頭和l2接頭兩者都是蛋白酶可裂解的肽接頭。在各種實施方案中，pd1?ab-il-2?vitokine構建體的l1是蛋白酶可裂解的肽接頭，并且l2是不可裂解的肽接頭。在各種實施方案中，pd1?ab-il-2?vitokine構建體的l1是不可裂解的肽接頭，并且l2是蛋白酶可裂解的肽接頭。在各種實施方案中，pd1ab-il-2vitokine構建體的l1接頭和l2接頭兩者都是蛋白酶不可裂解的肽接頭。在各種實施方案中，不可裂解的接頭g/s含量豐富(例如，接頭中至少約60％、70％、80％、90％或更多的氨基酸是g或s)。每個肽接頭序列可以獨立地選擇。在各種實施方案中，蛋白酶可裂解的接頭選自seq?id?no:54-77中列出的序列的組。在各種實施方案中，蛋白酶可裂解的接頭可以在可裂解接頭的n末端或在可裂解接頭的c末端或可裂解接頭的兩個末端具有可變長度的另外的肽間隔物，以改善酶促裂解的可及性。在各種實施方案中，在可裂解接頭的n末端或c末端或兩個末端上具有可變長度的肽間隔物的蛋白酶可裂解接頭選自seq?id?no:78-94中列出的序列的組。在各種實施方案中，不可裂解的接頭選自seq?id?no:95-115中列出的序列的組。在各種實施方案中，接頭是柔性的或剛性的，并且具有各種長度。在各種實施方案中，vitokine構建體的il-2結構域(d2)和il-2rα結構域(d3)被放置在pd1?ab結構域(d1)的c末端處，如圖1a中描繪的。在各種實施方案中，vitokine構建體的d2結構域和d3結構域被置于d1結構域的n末端處，如圖1b中描繪的。在各種實施方案中，pd1?ab-il-2?vitokine構建體的pd1阻斷ab、il-2結構域和il-2rα結構域可以是單體、或二聚體、或二聚體和單體的組合，諸如pd1阻斷ab是二聚體并且il-2結構域和il-2rα結構域是單體。在另一方面，本公開內容提供了用于治療受試者的癌癥或癌癥轉移的方法，該方法包括向有相應需要的受試者施用治療有效量的本發明的藥物組合物。在一種實施方案中，受試者是人類受試者。在各種實施方案中，癌癥選自胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、黑素瘤、白血病、骨髓增生異常綜合征、肺癌、前列腺癌、腦癌、膀胱癌、頭頸癌或橫紋肌肉瘤或任何癌癥。在另一方面，本公開內容提供了一種用于治療受試者的癌癥或癌癥轉移的方法，該方法包括施用與第二療法組合的治療有效量的本發明的藥物組合物，所述第二療法選自由以下組成的組：細胞毒性化學療法、免疫療法、小分子激酶抑制劑靶向療法、手術、放射療法、干細胞移植、細胞療法包括嵌合抗原受體(car)-t、car-nk、誘導多能干細胞(ips)誘導的car-t或ips誘導的car-nk、以及疫苗諸如卡介苗(bacille?calmette-guerine，bcg)。在各種實施方案中，組合療法可以包括向受試者施用治療有效量的免疫療法，所述免疫療法包括但不限于，使用針對特定腫瘤抗原的消耗性抗體的治療；使用抗體-藥物綴合物的治療；使用針對共刺激性或共抑制性分子(免疫檢查點)(諸如ctla-4、pd-l1、cd40、ox-40、cd137、gitr、lag3、tim-3、siglec-7、siglec-8、siglec-9、siglec-15和vista)的激動性抗體、拮抗性抗體或阻斷性抗體的治療；使用雙特異性t細胞結合抗體諸如博納吐單抗(blinatumomab)的治療；涉及施用生物響應調節劑(諸如il-12、il-21、gm-csf、ifn-α、ifn-β和ifn-γ)的治療；使用治療性疫苗諸如sipuleucel-t的治療；使用樹突細胞疫苗或腫瘤抗原肽疫苗的治療；使用car-t細胞的治療；使用car-nk細胞的治療；使用腫瘤浸潤性淋巴細胞(til)的治療；使用過繼轉移的抗腫瘤t細胞(離體擴增的t細胞和/或tcr轉基因的t細胞)的治療；使用tall-104細胞的治療；和使用免疫刺激劑諸如toll樣受體(tlr)激動劑cpg和咪喹莫特的治療；以及使用疫苗諸如bcg的治療；其中組合療法提供了增加的對腫瘤細胞的效應細胞殺傷，即，當被共施用時，vitokine構建體和免疫療法之間存在協同作用。在另一方面，本公開內容提供了本發明的藥物組合物在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。在另一方面，本公開內容提供了分離的核酸分子，該分離的核酸分子包含編碼本公開內容的藥物組合物的多核苷酸。在另一方面，本公開內容提供了包含本文描述的核酸的載體。在各種實施方案中，載體是表達載體。在另一方面，本公開內容提供了包含本公開內容的核酸的分離的細胞。在各種實施方案中，細胞是包含本公開內容的表達載體的宿主細胞。在另一方面，制備vitokine構建體的方法通過在促進蛋白或多肽的表達的條件下培養宿主細胞來提供。在另一方面，本公開內容提供了一種藥物組合物，包含與藥學上可接受的運載體(carrier)混合的本發明的分離的藥物組合物。附圖簡述圖1描繪了代表性的vitokine構建體形式。圖1a描繪了d2(活性部分結構域)和d3(遮蔽部分結構域)被置于d1(靶向結構域)的c末端處的vitokine構建體。圖1b描繪了d2結構域和d3結構域被置于d1結構域的n末端處的vitokine構建體。圖2描繪了本發明的pd1?ab-il-2?vitokine構建體的提出的活化機制。示例性vitokine構建體包含兩個蛋白酶可裂解的接頭；由l1接頭裂解導致的蛋白酶1活化產生活性形式1；由l2接頭裂解導致的蛋白酶2活化產生活性形式2；由l1接頭和l2接頭裂解導致的兩種蛋白酶活化產生活性形式3。蛋白酶裂解后，遮蔽部分結構域(d3)將從活性部分結構域(d2)釋放和擴散。如果l1接頭是唯一的蛋白酶可裂解接頭，則活性形式1將是唯一的活化形式。類似地，如果l2接頭是唯一的蛋白酶可裂解接頭，則活性形式2將是單一的活化形式。圖3a描繪了本發明的代表性pd1?ab-il-2?vitokine構建體。作為活性部分結構域(d2)的單體il-2或il-2變體在其n末端處用l1接頭與pd1抗體異源二聚體fc(d1)的c末端融合；il-2部分的c末端用l2接頭與作為遮蔽部分結構域(d3)的il-2rα或il-2rα變體的n末端融合。圖3b描繪了代表性的pd1?ab-il-2免疫細胞因子，其也充當非vitokine免疫細胞因子對應物。圖4描繪了在螢光素酶報告物測定中參考抗體(p-0734)與帕博利珠單抗(pbl)生物類似物之間的pd1阻斷活性的比較。圖4a和圖4b分別描繪了發光信號和誘導倍數的劑量依賴性增加。p-0734和pbl生物類似物共有相同的可變結構域，并分別具有igg1和igg4同種型。圖5描繪了pd1阻斷抗體p-1148、p-1150、p-1151和p-1153與參考抗體(p-0734)相比的(a)elisa結合和(b-c)pd1阻斷活性，如在螢光素酶報告物測定中測試的。圖5b和圖5c分別描繪了發光信號和誘導倍數的劑量依賴性增加。圖6描繪了pd1阻斷抗體p-1127、p-1129和p-1174與參考抗體(p-0734)相比的pd1阻斷活性。在螢光素酶報告物測定中對它們進行了測試，并圖示出了發光信號中的劑量依賴性增加。圖7描繪了pd1阻斷抗體p-1175和p-1181與參考抗體(p-0734)相比的pd1阻斷活性，如在螢光素酶報告物測定中測試的。圖7a和圖7b分別描繪了發光信號和誘導倍數的劑量依賴性增加。圖8描繪了pd1阻斷抗體p-1175、p-1176、p-1177和p-1178與參考抗體(p-0734)相比的pd1阻斷活性，如在螢光素酶報告物測定中測試的。圖8a和圖8b分別描繪了發光信號和誘導倍數的劑量依賴性增加。圖9描繪了pd1阻斷抗體p-1198、p-1199和p-1201與參考抗體(p-0734)相比的pd1阻斷活性，如在螢光素酶報告物測定中測試的。圖9a和圖9b分別描繪了發光信號和誘導倍數的劑量依賴性增加。包括非靶向種系抗體作為陰性對照。圖10描繪了pd1阻斷抗體p-1194、p-1201和p-1238與參考抗體(p-0734)相比的pd1阻斷活性，如在螢光素酶報告物測定中測試的。圖10a和圖10b分別描繪了發光信號和誘導倍數的劑量依賴性增加。圖11描繪了與參考抗體(p-0734)相比，pd1阻斷抗體p-1174、p-1193、p-1198、p-1199和p-1201與pd1+hek293細胞的結合。圖11a和圖11c描繪了陽性細胞百分比的劑量依賴性增加，并且圖11b和圖11d描繪了平均熒光強度(mfi)的劑量依賴性增加。圖12描繪了il-2rαsushi變體p-0751、p-0752和p-0753與il-2的elisa結合。p-0757包含野生型il-2rαsushi并被包括在內用于比較。圖13描繪了具有野生型il-2rαsushi作為d3結構域(p-0701)或il-2rαsushi變體作為d3結構域(p-0754、p-0755和p-0756)的fc?il-2?vitokine的活性評估。p-0704，一種il-2?p65r變體fc融合蛋白，被包括作為完全活性的il-2對照。通過使用流式細胞術分析人類pbmc的a)cd8+t細胞和b)nk細胞上ki67表達的誘導來評估活性。圖14描繪了il-2變體與il-2rα的elisa結合。每種il-2變體在位置p65處含有不同的氨基酸取代(關于分子信息的細節參見表18)。p-0531和p-0689分別用作二價形式和單價形式的野生型il-2對照。圖15描繪了il-2?p65變體在cd4+treg細胞中刺激stat5磷酸化的效力(關于分子信息的細節參見表18)。p-0531和p-0689分別用作二價形式和單價形式的野生型il-2對照。類似地，基準(d)和基準分別是il-2f42a/y45a/l72g變體的二價形式和單價形式。圖16通過分析a)與重組表達的il-2受體亞基β和γ復合物結合的elisa，和b)使用流式細胞術在新鮮人類pbmc中cd8+t細胞上ki67表達的誘導，描繪了il-2?p65變體對il-2rβγ的活性。關于il-2變體的分子信息的詳細信息，參見表18。p-0531和p-0689分別用作二價形式和單價形式的野生型il-2對照。圖17描繪了與非vitokine免疫細胞因子對應物p-0782相比，各種替代物小鼠pd1ab-il-2?vitokine?p-0800、p-0830、p-0831和p-0802的活性評估。這是通過分析人類pbmc的a)cd8+t細胞和b)nk細胞上ki67表達的誘導來完成的。四種il-2抗體vitokine僅在其il-2部分結構域與il-2rα的結合強度上不同。圖18描繪了il-2變體p-0731、p-0759和p-0761的活性評估，所述變體含有破壞其與il-2rβ相互作用的突變。該評價基于它們對在人類pbmc的a)cd8+t細胞和b)nk細胞上誘導ki67表達的作用。所有這些il-2變體還具有消除了與il-2rα結合的p65r突變。p-0704用作完全活性的il-2對照。圖19描繪了含有干擾其結合至γc的突變的il-2變體的活性評價。該評估基于它們對誘導人類pbmc的cd8+t細胞(a、c和e)和nk細胞(b、d、f)上的ki67表達的作用。所有這些il-2變體還具有消除il-2rα結合的p65r突變。p-0704起完全活性的il-2對照的作用。圖20描繪了與僅含有γc干擾突變的p-1158相比，含有靶向il-2rβ和γc兩者的突變的il-2變體的p-1247的活性評估。通過分析對人類pbmc的a)cd8+t細胞和b)nk細胞上的ki67表達誘導的作用來進行評價。p-0704用作il-2完全激動劑對照。圖21描繪了在螢光素酶報告物測定中，pd1阻斷抗體p-1174、p-1238和p-1271與它們各自的pd1?ab-il-2?vitokine?p-1197、p-1239和p-1272相比的pd1阻斷活性。圖21a和圖21b分別描繪了發光信號和誘導倍數的劑量依賴性增加。圖22描繪了pd1?ab-il-2?vitokine?p-0872、p-1197和p-1272與它們對應的非vitokine免疫細胞因子對應物p-0879和p-1271相比的固有基礎il-2活性的評估。活性評價基于分析人類pbmc的cd8+t細胞(a和c)和nk細胞(b和d)上增殖標志物ki67的誘導。三種vitokine僅在d1結構域組成上不同，即它們含有不同的pd1阻斷抗體。p-1174(p-1197的組分pd1抗體)被包括作為該測定的陰性對照。圖23描繪了pd1?ab-il-2?vitokine的蛋白酶裂解和活化。該圖包括a)示出p-1272的完整形式和活性形式兩者的還原性sds-page凝膠，以及b)vitokine?p-1272相比于其非vitokine對應物p-1273、c)vitokine?p-0831相比于其非vitokine對應物p-0838，和d)vitokine?p-1345相比于其非vitokine對應物p-0838在cd8+t細胞上的ki67表達的劑量依賴性誘導的展示。圖24描繪了在c57b/l6小鼠中單次腹膜內注射后小鼠pd1?ab-il-2?vitokine(p-0831)及其非vitokine免疫細胞因子等同物p-0838的血清濃度。在給藥后的多個時間點從小鼠收集血液，并使用elisa測定法確定化合物的血清水平。圖25描繪了單劑量p-0831(一種小鼠pd1?ab-il-2?vitokine)對c57b/l6小鼠外周血中a)cd8+t細胞、b)顆粒酶b+cd8+t細胞、c)nk細胞和d)顆粒酶b+nk細胞擴增的劑量和時間依賴性效應。p-0838(其非vitokine免疫細胞因子等同物)被包括在內以進行比較。在第0天、第3天、第5天、第7天和第10天收集血液以便通過facs分析進行淋巴細胞表型分析。數據表示為平均值±sem。圖26描繪了在初始c57bl/6小鼠中，單劑量p-0831(一種小鼠pd1?ab-il-2vitokine)對(a)炎癥標志物ifnγ的血清水平的劑量依賴性增加和(b)跨不同劑量水平的體重變化的作用。p-0838(其非vitokine免疫細胞因子等同物)被包括在內以進行比較。另外，將媒介物(pbs)及其組分小鼠pd1抗體p-0722用作陰性對照。圖27描繪了在每10天施用一次(q10d)的兩個劑量后p-0831(一種小鼠pd1?ab-il-2vitokine)在已建立的mc38鼠結腸癌模型中的抗腫瘤作用。呈現了對于a)3mg/kg的p-0831、b)6mg/kg的p-0831、c)9mg/kg的p-0831、和d)1mg/kg的p-0838(p-0831的非vitokine免疫細胞因子等同物)，個體小鼠中mc38腫瘤的生長曲線。為了比較，用虛線繪制媒介物組的平均腫瘤體積±平均值的標準誤差(sem)隨時間的變化。每個處理組的平均腫瘤體積±sem隨時間的變化圖示于圖27e中，并且每個處理組的體重隨時間的變化示出圖27f中。圖28描繪了在以6mg/kg的劑量處理后5天分離的腫瘤組織中p-0831(一種小鼠pd1ab-il-2?vitokine)的作用的免疫組織化學(ihc)分析。將組織切片固定在10％福爾馬林中，石蠟包埋，處理，并通過histowiz用抗體染色以評價腫瘤組織中的免疫細胞。為了比較，p-0722(其組分小鼠pd1抗體)以6mg/kg的劑量包括在內，并且p-0838(其非vitokine免疫細胞因子對應物)以1mg/kg的劑量包括在內。圖29描繪了p-0831在人類pbmc中的離體活性和在具有已建立的ct26鼠腫瘤的小鼠中的體內抗腫瘤功效，與其不可裂解的vitokine對應物p-0877相比較。體外評估測量在新鮮人類pbmc的a)cd8+t細胞和b)nk細胞上增殖標志物ki67的誘導。體內分析包括c)平均腫瘤體積±sem和d)ct26鼠模型中每個處理組在兩個q12d?10mg/kg的劑量后體重隨時間的變化。p-0879用作人類pbmc測定中的完全活性的il-2免疫細胞因子對照。以10mg/kg給藥的p-0722(p-0831的組分小鼠pd1抗體)被包括作為腫瘤模型中的對照。圖30描繪了與p-0831的非靶向vitokine對應物p-0871及其組分小鼠pd1抗體p-0722相比，p-0831在具有已建立的ct26鼠腫瘤的小鼠中的體內抗腫瘤功效。在兩個q12d10mg/kg的劑量后，繪制ct26鼠模型中每個處理組的平均腫瘤體積±sem隨時間的變化。圖31通過分析小鼠pd1?ab-il-2免疫細胞因子p-0782、p-0783和p-0786對a)在人類cd8+t細胞上誘導ki67表達、b)在人類nk細胞上誘導ki67表達，和c)小鼠ctll-2細胞增殖的作用，描繪了小鼠pd1?ab-il-2免疫細胞因子p-0782、p-0783和p-0786的活性評估。圖32描繪了幾種小鼠pd1?ab-il-2免疫細胞因子的劑量依賴性和時間藥效學作用。這包括a)外周cd8+t細胞的擴增、b)外周nk細胞的擴增，和c)在c57b/l6小鼠中2mg/kg的單劑量后體重的變化。在第0天、第3天、第5天、第7天和第10天收集血液以便通過facs分析進行淋巴細胞表型分析。數據表示為平均值±sem。圖33描繪了在0.5mg/kg的兩個q12d處理后，在已建立的mc38鼠結腸癌模型中幾種小鼠pd1?ab-il-2免疫細胞因子的抗腫瘤功效。每個處理組的平均腫瘤體積±sem隨時間的變化圖示于圖33a中，并且在第一劑量后第26天小鼠中的個體腫瘤體積示出于圖33b中。圖34描繪了兩種小鼠pd1?ab-il-2免疫細胞因子p-0783和p-0786在已建立的mc38鼠結腸癌模型中在0.3mg/kg的兩個q10d劑量后的抗腫瘤功效。每個處理組的平均腫瘤體積±sem隨時間的變化圖示于圖34a中。對于b)p-0783和c)p-0786，圖示了小鼠皮下mc38腫瘤的個體生長曲線。圖35描繪了在1mg/kg的兩個q10d處理后，在已建立的mc38鼠結腸癌模型中p-0786(一種小鼠pd1?ab-il-2免疫細胞因子)的抗腫瘤功效。這包括a)平均腫瘤體積±sem和b)每個處理組的體重隨時間的變化。包括以9mg/kg給藥的組分小鼠pd1抗體p-0722用于比較。圖36描繪了p-0786(一種小鼠pd1?ab-il-2免疫細胞因子)在已建立的mc38鼠結腸癌模型中不同劑量水平的兩個q14d處理后的劑量依賴性抗腫瘤功效。每個處理組的平均腫瘤體積±sem隨時間的變化圖示于圖36a中。圖示了b)0.03mg/kg、c)0.1mg/kg、d)0.3mg/kg和e)1mg/kg劑量的個體腫瘤生長曲線。包括媒介物組的平均腫瘤體積±sem隨時間的變化(表示為虛線)用于比較。圖37描繪了在p-0786處理的無腫瘤小鼠中mc38結腸癌細胞的再攻擊植入后沒有腫瘤復發。這與作為對照的年齡匹配的初始小鼠中相同類型腫瘤的成功再生形成對比。圖38描繪了p-0786作為單一劑在兩個另外的皮下同基因腫瘤模型中抑制腫瘤生長的功效。這些模型包括a)ct26鼠結腸癌腫瘤模型和b)b16f10鼠黑素瘤腫瘤模型。用于實施本公開內容的方式在一方面，本公開內容提供了包含3個結構域：作為til靶向部分的優化的pd1阻斷抗體、作為活性部分結構域的il-2變體和作為遮蔽部分結構域的il-2rαsushi變體的pd1ab-il-2?vitokine構建體。重要的是，il-2rαsushi變體結構域能夠遮蔽或減弱il-2結構域的功能活性，直到在意圖的治療部位處被活化。pd1阻斷抗體將vitokine引導至腫瘤微環境中的til，并將vitokine的活化限制在局部以改善治療指數。在各種實施方案中，pd1阻斷抗體通過在帕博利珠單抗的可變結構域中的修飾來優化。在各種實施方案中，修飾涉及cdr殘基的種系序列取代、框架殘基的種系序列取代和采用vh3人類種系家族序列作為受體框架。在各種實施方案中，這些修飾單獨地或組合地實施以開發優化的pd1阻斷抗體。在各種實施方案中，這些優化的pd1阻斷抗體表現出對pd1的高結合親和力，以與帕博利珠單抗相同或相當的效力起抑制pd1的作用，與其最接近的人類種系序列具有更高的序列相似性評分，與帕博利珠單抗相比導致提高的人源性程度，并且預測具有較低的疏水性，導致降低的聚集傾向。在各種實施方案中，基于這些優化的pd1阻斷抗體的pd1?ab-il-2?vitokine構建體具有增強的可開發性特性。在各種實施方案中，il-2結構域是活性部分，但保持惰性，直到被病變組織中上調的蛋白酶在局部活化；這將限制活性部分與非病變細胞或組織的外周中或細胞表面上的受體的結合，以防止途徑的過度活化并減少不期望的“組織外”“中靶”毒性。vitokine的改進的安全性譜可以允許pd1抗體的有效范圍內的人類劑量水平。此外，在蛋白酶活化之前，vitokine活性部分的惰性將顯著降低潛在的抗原沉沒，并且從而延長體內半衰期，以及導致在意圖的治療部位處的生物分布、生物可利用度和功效的改進。在各種實施方案中，整合效力減弱的il-2變體作為活性部分結構域(通過破壞il-2rβγ相互作用實現的此類il-2變體)還可以微調vitokine的固有基礎活性和活化后活性。在各種實施方案中，具有效力減弱的il-2變體作為活性部分結構域的這樣的vitokine可以另外地擴展治療指數。在各種實施方案中，il-2的受體的獨特和非信號傳導α-亞基經由蛋白酶可裂解接頭用作遮蔽部分結構域，以可逆地遮蔽細胞因子活性。遮蔽α-亞基可以優選在接頭的蛋白酶裂解后解離離開。因此，α-受體的氨基酸修飾以調節對il-2的結合親和力可能是有益的。在各種實施方案中，在pd1?ab-il-2?vitokine構建體中，三個結構域使用具有可變長度和剛性的兩個接頭連接，并且任選地與蛋白酶可裂解序列偶聯。這些蛋白酶可裂解序列是在疾病部位具有升高或失調表達的特定蛋白酶亞型的肽底物，因此允許在疾病的部位處顯示出或釋放功能il-2結構域。對接頭長度和構成進行微調，以確保il-2結構域自接近其受體的最佳遮蔽，從而最小化全身性參與。同時，維持vitokine構建體在血液循環中的穩定性，同時允許在意圖治療部位處遇到特定蛋白酶時的有效裂解。在另一方面，本公開內容提供了旨在將活性調節的il-2結構域直接靶向腫瘤浸潤性淋巴細胞的新的pd1靶向性il-2免疫細胞因子。在各種實施方案中，pd1阻斷抗體通過在帕博利珠單抗的可變結構域中的修飾來優化。在各種實施方案中，預測基于優化的pd1阻斷抗體的靶向il-2免疫細胞因子具有增強的可開發性特性。在各種實施方案中，活性調節的il-2結構域(單體)與異源二聚體pd1抗體重鏈的c末端融合。在各種實施方案中，pd1靶向性il-2免疫細胞因子中的il-2結構域是il-2rβγ選擇性的和效力減弱的。在各種實施方案中，il-2效力減弱利于在細胞因子和抗體組分之間建立化學計量平衡，有助于緩解途徑過度活化，并減輕抗原沉沒和靶介導的沉積。在各種實施方案中，在pd1靶向性il-2免疫細胞因子中使用效力減弱的il-2變體(這樣的變體與γc具有受損的相互作用)可在減輕抗原沉沒中提供另外的益處，并繼而導致體內半衰期延長，這可能是因為γc受體在信號級聯中的影響導致細胞擴增。定義除非本文另有定義，否則與本發明相關使用的科學和技術術語應具有本領域普通技術人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數術語應包括復數，且復數術語應包括單數。通常，本文描述的關于細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白和核酸化學和雜交使用的命名和技術是本領域常用和熟知的那些。除非另有指示，否則本發明的方法和技術通常根據本領域熟知的常規方法和貫穿本說明書中引用和討論的各種一般和更具體的參考文獻中的描述來進行。參見例如，green和sambrook,molecular?cloning:alaboratory?manual,4th?ed.,cold?spring?harbor?laboratorypress,cold?spring?harbor,n.y.(2012)，通過引用并入本文。酶促反應和純化技術根據生產商的說明書進行，如本領域通常完成或如本文描述的。本文描述的關于分析化學、合成有機化學和藥物及制藥化學使用的命名以及實驗程序和技術是本領域通常使用和熟知的那些。對于化學合成、化學分析、藥物制備、配制和遞送以及受試者治療使用標準技術。術語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互換地使用，是指氨基酸殘基的聚合物。在各種實施方案中，“肽”、“多肽”和“蛋白”是氨基酸的α碳通過肽鍵連接的氨基酸的鏈。因此在鏈的一個末端(氨基末端)處的末端氨基酸具有游離氨基基團，而在鏈的另一個末端(羧基末端)處的末端氨基酸具有游離羧基基團。如本文使用的，術語“氨基末端”(縮寫為n末端)是指在肽的氨基末端處的氨基酸上的游離α-氨基基團，或指在肽中的任何其他位置處的氨基酸的α-氨基基團(參與肽鍵時的氨基基團)。類似地，術語“羧基末端”(縮寫為c末端)是指肽的羧基末端上的游離羧基基團，或肽中任何其他位置處的氨基酸的羧基基團。肽還包括基本上任何多氨基酸，包括但不限于肽模擬物(peptide?mimetic)諸如通過醚鍵而非酰胺鍵連接的氨基酸。本公開內容的多肽包括已經以任何方式和出于任何原因被修飾的多肽，例如，以：(1)降低對蛋白水解的易感性，(2)降低對氧化的易感性，(3)改變形成蛋白復合物的結合親和力，(4)改變結合親和力，和(5)賦予或改變其他物理化學特性或功能特性。如本文使用的氨基酸“取代”是指用不同的氨基酸替換多肽中親本多肽序列的特定位置處的一個氨基酸。氨基酸取代可以使用本領域熟知的遺傳方法或化學方法來產生。例如，單個氨基酸取代或多于一個氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)可以在天然存在的序列中進行(例如，在形成分子間接觸的一個或更多個結構域以外的一部分多肽中進行)。“保守氨基酸取代”是指在多肽中氨基酸被功能上相似的氨基酸取代。以下六組各自包含彼此為保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(a)、絲氨酸(s)和蘇氨酸(t)2)天冬氨酸(d)和谷氨酸(e)3)天冬酰胺(n)和谷氨酰胺(q)4)精氨酸(r)和賴氨酸(k)5)異亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)和纈氨酸(v)6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)和色氨酸(w)“非保守氨基酸取代”是指這些類別之一的成員取代為來自另一類別的成員。在進行這樣的改變中，根據各種實施方案，可以考慮氨基酸的親水指數(hydropathic?index)。基于氨基酸的疏水性和電荷特征，每種氨基酸已經被指定了親水指數。它們是：異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。本領域了解親水氨基酸指數在賦予蛋白相互作用的生物功能中的重要性(參見例如，kyte等人,1982,j.mol.biol.157:105-131)。已知某些氨基酸可以被具有相似的親水指數或評分的其他氨基酸取代，并且仍然保留相似的生物學活性。在基于親水指數進行改變中，在各種實施方案中，包括了其親水指數在±2內的氨基酸的取代。在各種實施方案中，包括在±1內的那些，并且在各種實施方案中，包括在±0.5內的那些。本領域還理解，可以基于親水性有效地進行相似的氨基酸的取代，特別是在從而產生的生物學上有功能的蛋白或肽被意在用于在如本文公開的免疫學實施方案中使用的情況中。在各種實施方案中，蛋白的最大局部平均親水性(如由其相鄰的氨基酸的親水性決定的)與其免疫原性和抗原性，即，與蛋白的生物學特性相關。以下親水性值已經被指定至這些氨基酸殘基：精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.±.1)；谷氨酸(+3.0.±.1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.±.1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似的親水性值進行改變中，在各種實施方案中，包括其親水性值在±2內的氨基酸的取代，在各種實施方案中，包括在±1內的那些，并且在各種實施方案中，包括在±0.5內的那些。示例性氨基酸取代在表1中列出。表1技術人員將能夠使用公知技術確定如本文列出的合適的多肽變體。在各種實施方案中，本領域技術人員可以通過靶向被認為對于活性不重要的區域來鑒定可以被改變而不破壞活性的分子的適合區域。在其他實施方案中，技術人員可以鑒定在相似多肽間保守的分子的殘基和部分。在另外的實施方案中，即使可能對生物活性或對結構重要的區域也可以經歷保守氨基酸取代，而不破壞生物活性或不會不利地影響多肽結構。此外，本領域技術人員可以回顧鑒定相似多肽中對活性或結構重要的殘基的結構-功能研究。鑒于這樣的比較，技術人員可以預測對應于相似多肽中對活性或結構重要的氨基酸殘基的多肽中的氨基酸殘基的重要性。本領域技術人員可以選擇對這樣預測的重要氨基酸殘基進行化學上相似的氨基酸取代。本領域技術人員還可以分析相似多肽中與該結構相關的三維結構和氨基酸序列。鑒于這樣的信息，本領域技術人員可以預測多肽的氨基酸殘基在其三維結構方面的排列。在各種實施方案中，本領域技術人員可以選擇不對預測在多肽表面上的氨基酸殘基進行根本改變(radical?changes)，因為此類殘基可能參與與其他分子的重要相互作用。此外，本領域技術人員可以產生在每個期望的氨基酸殘基處包含單個氨基酸取代的測試變體。然后可使用本領域技術人員已知的活性測定篩選變體。這樣的變體可被用于收集關于合適變體的信息。例如，如果人們發現，特定氨基酸殘基的改變導致破壞的、不期望地減少的或不合適的活性，則可以避免具有這樣的改變的變體。換句話說，基于從這樣的常規實驗收集的信息，本領域技術人員可以容易地確定應避免在該處單獨的或與其他突變組合的進一步取代的氨基酸。如本文使用的術語“多肽片段”和“截短的多肽”是指如與對應的全長蛋白相比具有氨基末端缺失和/或羧基末端缺失的多肽。在各種實施方案中，片段的長度可以是例如，至少5個、至少10個、至少25個、至少50個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少600個、至少700個、至少800個、至少900個或至少1000個氨基酸。在各種實施方案中，片段的長度還可以是例如，至多1000個、至多900個、至多800個、至多700個、至多600個、至多500個、至多450個、至多400個、至多350個、至多300個、至多250個、至多200個、至多150個、至多100個、至多50個、至多25個、至多10個或至多5個氨基酸。片段還可以在其任一個或兩個末端處包含一個或更多個另外的氨基酸，例如，來自不同的天然存在的蛋白的氨基酸的序列(例如，fc或亮氨酸拉鏈結構域)或人工氨基酸序列(例如，人工接頭序列)。本文使用的術語“多肽變體”、“雜合多肽”和“多肽突變體”是指包含氨基酸序列(其中相對于另一個多肽序列，一個或更多個氨基酸殘基被插入到該氨基酸序列中、從該氨基酸序列中缺失和/或被取代到該氨基酸序列中)的多肽。在各種實施方案中，待被插入、缺失或取代的氨基酸殘基的數目可以是例如，至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少10個、至少25個、至少50個、至少75個、至少100個、至少125個、至少150個、至少175個、至少200個、至少225個、至少250個、至少275個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個或至少500個氨基酸的長度。本公開內容的雜合體包括融合蛋白。多肽的“衍生物”是已經被化學修飾的多肽，所述化學修飾例如，綴合至另一個化學部分(諸如例如，聚乙二醇、白蛋白(例如，人類血清白蛋白))、磷酸化和糖基化。術語“％序列同一性”與術語“％同一性”在本文中可互換地使用并且是指當使用序列比對程序比對時，在兩個或更多個肽序列之間的氨基酸序列同一性的水平或在兩個或更多個核苷酸序列之間的核苷酸序列同一性的水平。例如，如本文使用的，80％同一性與通過定義的算法確定的80％序列同一性意指相同的意思，并且意指給定序列與另一長度的另一序列至少80％相同。在各種實施方案中，％同一性選自，例如，與給定的序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％或更大的序列同一性。在各種實施方案中，％同一性在例如約60％至約70％、約70％至約80％、約80％至約85％、約85％至約90％、約90％至約95％或約95％至約99％的范圍內。術語“％序列同源性”與術語“％同源性”在本文中可互換使用并且指當使用序列比對程序比對時，在兩個或更多個肽序列之間的氨基酸序列同源性的水平或在兩個或更多個核苷酸序列之間的核苷酸序列同源性的水平。例如，如本文使用的，通過定義的算法確定的80％同源性與80％序列同源性意指相同的意思，并且因此給定序列的同源物具有相對于給定序列的長度大于80％的序列同源性。在各種實施方案中，％同源性選自例如與給定的序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％或更大的序列同源性。在各種實施方案中，％同源性在例如約60％至約70％、約70％至約80％、約80％至約85％、約85％至約90％、約90％至約95％或約95％至約99％的范圍內。可以用于確定兩個序列之間的同一性的示例性計算機程序包括但不限于在互聯網在ncbi的網站上公開地可得的一套blast程序，例如blastn、blastx和tblastx、blastp和tblastn。還參見altschul等人,j.mol.biol.215:403-10,1990(特別參考公開的默認設置，即參數w＝4、t＝17)和altschul等人,nucleic?acids?res.,25:3389-3402,1997。當相對于genbank蛋白序列和其他公開數據庫中的氨基酸序列評價給定的氨基酸序列時，通常使用blastp程序進行序列搜索。blastx程序優選用于針對在genbank蛋白序列和其他公開數據庫中的氨基酸序列搜索在所有閱讀框中已經被翻譯的核酸序列。使用開放空位(gap)罰分為11.0和延伸空位罰分為1.0的默認參數并且使用blosum-62矩陣運行blastp和blastx兩者。除了計算序列同一性百分比以外，blast算法還進行兩個序列之間相似性的統計分析(參見，例如，karlin&altschul,proc.natl.acad.sci.usa,90:5873-5787,1993)。由blast算法提供的相似性的一個量度是最小總概率(p(n))，該最小總概率提供在兩個核苷酸序列或氨基酸序列之間的匹配將偶然發生的概率的指示。例如，如果在測試核酸與參考核酸的比較中，最小總概率為例如小于約0.1、小于約0.01或小于約0.001，則該核酸被認為與參考序列相似。如本文使用的術語“修飾”是指對肽主鏈(例如氨基酸序列)的任何操作或對多肽的翻譯后修飾(例如糖基化)。如本文使用的術語“knob-into-hole修飾”是指兩個免疫球蛋白重鏈的ch3結構域之間的界面內的修飾。在一種實施方案中，“knob-into-hole修飾”包含一條抗體重鏈中的氨基酸取代t366w和任選的氨基酸取代s354c，以及另一條抗體重鏈中的氨基酸取代t366s、l368a、y407v和任選的y349c。knob-into-hole技術在例如美國專利第5,731,168號；美國專利第7,695,936號；ridgway等人,prot?eng?9,617-621(1996)和carter,j?immunol?meth248,7-15(2001)中描述。如本文使用的術語“可生物活化藥物”或“vitokine”意指這樣的化合物，該化合物是一種藥物前體，在被施用至受試者后，經由一些化學加工或生理加工在體內釋放藥物，使得可生物活化藥物轉化為對靶組織有活性的產物。可生物活化藥物是經歷生物活化然后表現出其藥理學作用的任何化合物。因此，可生物活化藥物可被視為包含專門的無毒保護性基團的藥物，所述專門的無毒保護性基團以暫時的方式用于改變或消除母體分子的不期望的特性。如本文使用的術語“免疫綴合物”或“融合蛋白”是指包含直接地或間接地與效應物分子綴合(或連接)的抗體或其抗原結合片段的分子。效應物分子可以是可檢測的標記物、免疫毒素、細胞因子、趨化因子、治療劑或化學治療劑。抗體或其抗原結合片段可以經由肽接頭與效應物分子綴合。免疫綴合物和/或融合蛋白保留抗體或抗原結合片段的免疫反應性，例如抗體或抗原結合片段在綴合后具有與綴合前近似地相同的或僅略微降低的與抗原結合的能力。如本文使用的，免疫綴合物也可以被稱作抗體藥物綴合物(adc)。因為免疫綴合物和/或融合蛋白最初從具有單獨的功能的兩種分子制備，諸如抗體和效應物分子，它們有時也被稱作“嵌合分子”。“接頭”是指共價地或通過離子鍵、范德華力或氫鍵連接兩個其他分子的分子，例如在5’末端處與一個互補序列雜交并且在3’末端處與另一個互補序列雜交從而連接兩個非互補序列的核酸分子。“可裂解的接頭”是指可以被降解、消化或以其他方式切斷以使通過該可裂解的接頭連接的兩個組分分開的接頭。可裂解的接頭通常被酶，通常是肽酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等裂解。可裂解的接頭還可以通過環境因素，諸如例如溫度、ph、鹽濃度等的改變來裂解。如本文使用的術語“肽接頭”是指包含一個或更多個氨基酸，通常為約1個-30個氨基酸的肽。肽接頭是本領域已知的或在本文中被描述。合適的非免疫原性的接頭肽包括例如(g4s)n、(sg4)n或g4(sg4)n肽接頭。“n”通常是1和10之間，通常2和4之間的數字。“藥物組合物”是指適用于動物中的藥學用途的組合物。藥物組合物包含藥理學有效量的活性劑和藥學上可接受的運載體。“藥理學有效量”是指有效產生預期藥理學結果的劑的量。“藥學上可接受的運載體”是指任何標準的藥物運載體、媒介物、緩沖劑和賦形劑，諸如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、5％右旋糖的水性溶液，和乳液，諸如油/水乳液或水/油乳液，和多種類型的潤濕劑和/或佐劑。合適的藥學運載體和制劑在remington’s?pharmaceuticalsciences,第21版2005,mack?publishing?co,easton中描述。“藥學上可接受的鹽”是可以被配制成用于藥學用途的化合物的鹽，包括例如金屬鹽(鈉、鉀、鎂、鈣等)和氨的鹽或有機胺的鹽。如本文使用的，“治療(treatment)”(及其語法變化形式諸如“治療(treat)”或“治療(treating)”)是指試圖改變被治療的個體的疾病的自然過程的臨床干預，并且臨床干預可以用于預防來進行或者在臨床病理過程期間進行。期望的治療效果包括但不限于，防止疾病的發生或復發、減輕癥狀、減輕疾病的任何直接或間接病理后果、防止轉移、降低疾病進展速度、改善或緩和疾病狀態以及緩解或改善預后。如本文使用的，“減輕”疾病、紊亂或狀況意指降低疾病、紊亂或狀況的癥狀的嚴重性和/或發生頻率。另外，本文中述及“治療”包括述及治愈性、緩解性和預防性治療。如本文使用的術語“有效量”或“治療有效量”是指足以治療特定紊亂、狀況或疾病，諸如改善、緩和、減輕和/或延遲其一種或更多種癥狀的化合物或組合物的量。述及癌癥或其他不期望的細胞增殖，有效量包括足以實現以下的量：(i)降低癌細胞的數目；(ii)降低腫瘤尺寸；(iii)在一定程度抑制、延緩、減緩并且優選地停止癌細胞浸潤到外周器官中；(iv)抑制(即，在一定程度減緩并且優選地停止)腫瘤轉移；(v)抑制腫瘤生長；(vi)預防或延遲腫瘤的發生和/或復發；和/或(vii)在一定程度減輕一種或更多種與癌癥相關的癥狀。有效量可以以一次或更多次施用來施用。措辭“施用”或“引起施用(cause?to?be?administered)”是指由醫學專業人員(例如醫師)或控制患者的醫療護理的人員采取的控制和/或允許向患者施用所討論的劑/化合物的行動。引起施用可以包括診斷和/或確定合適的治療方案，和/或為患者開特定的劑/化合物的處方。這樣的開處方可以包括例如起草處方形式、注釋醫療記錄等。當本文中描述施用時也設想了“引起施用”。術語“患者”、“個體”和“受試者”可以互換地使用，并且指哺乳動物，優選人類或非人類靈長類動物，但也指家養哺乳動物(例如犬科動物或貓科動物)、實驗室哺乳動物(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠、豚鼠)和農業哺乳動物(例如馬科動物、牛科動物、豬、綿羊(ovine))。在各種實施方案中，患者可以是在醫院、精神病護理機構如門診或其他臨床環境中的醫師或其他衛生工作者的護理下的人類(例如，成年男性、成年女性、青少年男性、青少年女性、男性兒童、女性兒童)。在各種實施方案中，患者可以是免疫功能低下的患者或免疫系統減弱的患者，包括但不限于患有原發性免疫缺陷、aids的患者；服用某些免疫抑制藥物的癌癥患者和移植患者；以及患有影響免疫系統的遺傳性疾病(例如，先天性無丙種球蛋白血癥、先天性iga缺乏癥)的患者。在各種實施方案中，患者患有免疫原性癌癥，包括但不限于膀胱癌、肺癌、黑素瘤和報道具有高突變率的其他癌癥(lawrence等人,nature,499(7457):214-218,2013)。術語“免疫療法”是指包括但不限于以下的癌癥治療：使用針對特定腫瘤抗原的耗盡性抗體的治療；使用抗體-藥物綴合物的治療；使用針對共刺激分子或共抑制分子(免疫檢查點)(諸如ctla-4、pd1、pdl-1、cd40、ox-40、cd137、gitr、lag3、tim-3、sirpα、cd47、gitr、icos、cd27、siglec?7、siglec?8、siglec?9、siglec?15、vista、cd276、cd272、tim-3和b7-h4)的激動性抗體、拮抗性抗體或阻斷性抗體的治療；使用雙特異性t細胞結合抗體諸如博納吐單抗的治療；涉及施用生物響應調節劑(諸如il-2、il-4、il-7、il-10、il-12、il-15、il-21、il-22、gm-csf、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、tgf-β拮抗劑或tgf-β陷阱)的治療；使用治療性疫苗諸如sipuleucel-t的治療；使用治療性病毒(包括但不限于溶瘤病毒諸如t-vec)的治療；使用樹突細胞疫苗或腫瘤抗原肽疫苗或新抗原疫苗的治療；使用nk細胞的治療；使用嵌合抗原受體(car)-t細胞的治療；使用car-nk細胞的治療；使用dc或t細胞的治療；使用ips誘導的nk細胞的治療；使用ips誘導的t細胞的治療；使用疫苗諸如卡介苗(bcg)的治療；使用腫瘤浸潤性淋巴細胞(til)的治療；使用過繼轉移的抗腫瘤t細胞(離體擴增的t細胞和/或tcr-t細胞)的治療；使用tall-104細胞的治療；以及使用免疫刺激劑諸如toll樣受體(tlr)激動劑cpg、tlr7、tlr8、tlr9和咪喹莫特的治療。“耐受性或難治性癌癥”是指不響應于先前的抗癌療法的腫瘤細胞或癌癥，所述先前的抗癌療法包括例如化學療法、手術、放射療法、干細胞移植和免疫療法。腫瘤細胞可以在治療的開始時是耐受性或難治性的，或者它們可以在治療期間變成耐受性或難治性的。難治性腫瘤細胞包括在治療的開始時不響應的腫瘤，或最初持續短的時間段響應但不能響應治療的腫瘤。難治性腫瘤細胞還包括響應于使用抗癌療法的治療但不能響應于隨后幾輪療法的腫瘤。為了本發明的目的，難治性腫瘤細胞還包括通過使用抗癌療法的治療表現出被抑制但在治療停止后長達5年，有時長達10年或更長時間而復發的腫瘤。抗癌療法可以使用單獨的化學治療劑、單獨的放射、單獨的靶向療法、單獨的手術或其組合。為了便于描述而非限制，應理解，難治性腫瘤細胞與耐受性腫瘤是可互換的。術語“新抗原”是指例如免疫系統先前未暴露于其的細胞表面抗原，尤其是通過放射、化學療法、病毒感染、致瘤性轉化/突變、藥物代謝等改變宿主抗原而產生的細胞表面抗原，相對于大多數正常細胞，所述細胞表面抗原由癌細胞選擇性表達或在癌細胞中過表達。如本文使用的術語“抗體”以最寬泛的意義使用，并涵蓋多種抗體結構(igg1、2、3或4、igm、iga、ige)，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體或雙功能抗體)和抗體片段，條件為它們表現出期望的抗原結合活性。如本文使用的，術語“抗體片段”是指除完整抗體之外的分子，其包含完整抗體的一部分并且與完整抗體所結合的抗原結合。抗體片段的實例包括但不限于fv、fab、fab’、fab’-sh、f(ab’)2、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如，scfv)以及單結構域抗體。如本文使用的術語“fab片段”是指包含輕鏈的vl結構域和恒定結構域(cl)以及重鏈的vh結構域和第一恒定結構域(ch1)的免疫球蛋白片段。如本文使用的術語“可變區”或“可變結構域”是指通常參與免疫球蛋白或抗體與抗原結合的免疫球蛋白或抗體重鏈或輕鏈的結構域。免疫球蛋白或抗體的重鏈和輕鏈的可變結構域(分別為vh和vl)通常具有相似的結構，其中每個結構域包含四個保守的框架區(fr)和三個互補決定區(cdr)。術語“互補決定區”或“cdr”含有抗原接觸殘基(“抗原接觸”)。通常，抗體包含六個cdr：三個在vh中(cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3)，并且三個在vl中(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3)。在氨基酸殘基24-34(cdr-l1)、50-56(cdr-l2)、89-97(cdr-l3)、31-35b(cdr-h1)、50-65(cdr-h2)和95-102(cdr-h3)(kabat等人,sequences?of?proteins?of?immunologicalinterest,第5版public?health?service,national?institutes?of?health,bethesda,md(1991))處發生cdr。具有不同特異性的抗體(即，針對不同的抗原的不同結合位點)具有不同的cdr。盡管cdr在抗體與抗體之間變化，但在cdr中只有有限數目的氨基酸位置直接地參與抗原結合。cdr中的這些位置被稱為特異性決定殘基(sdr)。“單鏈抗體”是其中重鏈可變區和輕鏈可變區已經通過柔性接頭連接以形成單個多肽鏈的fv分子，該多肽鏈形成抗原結合區。單鏈抗體在國際專利申請公布第wo?88/01649號、美國專利第4,946,778號和第5,260,203號中詳細討論，這些申請的公開內容通過引用并入。如本文使用的“人類免疫球蛋白”是具有這樣的氨基酸序列的免疫球蛋白，該氨基酸序列對應于由人類或人類細胞產生的或利用人類免疫球蛋白組庫或其他人類免疫球蛋白編碼序列衍生自非人類來源的免疫球蛋白的氨基酸序列。人類免疫球蛋白的這一定義明確排除了包含非人類抗原結合殘基的人源化免疫球蛋白。如本文使用的術語“人源化抗體”是指包含人源化輕鏈和人源化重鏈免疫球蛋白的抗體。人源化抗體與提供cdr的供體抗體結合相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗體的受體框架可以具有通過取自供體框架的氨基酸的有限數目的取代，并且這樣的取代在本文中被稱為回復突變。人源化抗體或其他單克隆抗體可以具有另外的保守氨基酸取代，這些另外的保守氨基酸取代對抗原結合或其他免疫球蛋白功能基本上沒有影響。如本文使用的術語“fc結構域”或“fc區”用于定義免疫球蛋白重鏈的c末端區域，其包含至少一部分恒定區。該術語包括天然序列fc區和變體fc區。igg?fc區包含igg?ch2和igg?ch3結構域。本文中的ch3區可以是天然序列ch3結構域或變體ch3結構域(例如，在其一條鏈中具有引入的“突起”(“knob”)并且在其另一條鏈中具有相應的引入的“空腔”(“hole”)的ch3結構域；參見美國專利第5,821,333號，通過引用明確并入本文)。這樣的變體ch3結構域可以用于促進如本文描述的兩個不同的免疫球蛋白重鏈的異源二聚體化。除非本文中另外規定，否則fc區或恒定區中氨基酸殘基的編號根據eu編號系統。如本文使用的術語“效應子功能”是指可歸因于免疫球蛋白的fc區的那些生物活性，所述fc區隨免疫球蛋白亞型而不同。免疫球蛋白效應子功能的實例包括：c1q結合和補體依賴性細胞毒性(cdc)、fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)、抗體依賴性細胞吞噬作用(adcp)、細胞因子分泌、免疫復合物介導的抗原呈遞細胞的抗原攝取、細胞表面受體(例如，b細胞受體)的下調和b細胞活化。如本文使用的，“特異性結合”意指對抗原的結合是選擇性的，并且可以與不需要的或非特異性的相互作用區分開。免疫球蛋白結合特定抗原的能力可以通過酶聯免疫吸附測定(elisa)或本領域技術人員熟悉的其他技術例如表面等離子體共振(spr)技術來測量。如本文使用的術語“親和力”或“結合親和力”是指分子(例如，抗體)的單個結合位點與其結合配偶體(例如，抗原)之間的非共價相互作用的總和的強度。分子x對其配偶體y的親和力一般可以通過解離常數(kd)來呈現，解離常數是解離速率常數和結合速率常數(分別為koff和kon)的比率。用于測量親和力的特定方法是spr。如本文使用的術語“免疫原性”是指當被施用至接受者時，抗體或抗原結合片段引發免疫應答(體液應答或細胞應答)的能力，并且包括例如人類抗小鼠抗體(hama)應答。當來自受試者的t細胞對施用的抗體產生免疫應答時，啟動了hama應答。然后，t細胞募集b細胞以生成特異性“抗抗體(anti-antibody)”抗體。如本文使用的術語“免疫細胞”意指參與調控針對抗原(例如，自身抗原)的免疫應答的造血譜系的任何細胞。在各種實施方案中，免疫細胞是例如t細胞、b細胞、樹突細胞、單核細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、朗氏細胞或kuffer細胞。如本文使用的，術語“降低的結合”是指各自相互作用的親和力的降低，如例如通過spr測量的。相反，“增加的結合”是指各自相互作用的結合親和力的增加。如本文使用的術語“聚合物”通常包括但不限于均聚物；共聚物，諸如例如嵌段、接枝、無規和交替共聚物；和三元共聚物；以及它們的混合物和變化形式(modifications)。此外，除非另外明確限定，否則術語“聚合物”應包括材料的所有可能的幾何構型。這些構型包括但不限于全同立構、間同立構和無規對稱。“多核苷酸”是指包含核苷酸單元的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，諸如脫氧核糖核酸(“dna”)和核糖核酸(“rna”)以及核酸類似物。核酸類似物包括包含以下的那些：非天然存在的堿基，以天然存在的磷酸二酯鍵以外的連接與其他核苷酸銜接(engage)的核苷酸，或包含通過除了磷酸二酯鍵以外的連接附接的堿基的核苷酸。因此，核苷酸類似物包括例如并且不限于，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯(phosphorotriester)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-o-甲基核糖核苷酸、肽核酸(pna)等。這樣的多核苷酸可以例如使用自動化的dna合成儀來合成。術語“核酸”通常是指大的多核苷酸。術語“寡核苷酸”通常是指短的多核苷酸，通常不大于約50個核苷酸。將理解的是，當核苷酸序列由dna序列(即，a、t、g、c)表示時，這還包括其中“u”代替“t”的rna序列(即，a、u、g、c)。本文使用常規符號描述多核苷酸序列：單鏈多核苷酸序列的左手末端為5’-末端；雙鏈多核苷酸序列的左手方向被稱作5’-方向。向新生rna轉錄物5’至3’添加核苷酸的方向被稱作轉錄方向。具有與mrna相同的序列的dna鏈被稱作“編碼鏈”；在具有與從該dna轉錄的mrna相同的序列的dna鏈上并且位于rna轉錄物的5’-末端的5’的序列被稱作“上游序列”；在具有與rna相同的序列的dna鏈上并且在編碼rna轉錄物的3’-末端的3’的序列被稱作“下游序列”。“互補的”是指兩個多核苷酸的相互作用表面的拓撲相容性或匹配在一起。因此，這兩個分子可以被描述為互補的，并且更進一步地，接觸表面特征是彼此互補的。如果第一多核苷酸的核苷酸序列與第二多核苷酸的多核苷酸結合配偶體的核苷酸序列基本上相同，或者如果第一多核苷酸可以與第二多核苷酸在嚴格雜交條件下雜交，則第一多核苷酸與第二多核苷酸是互補的。“載體”是可以被用于將與其連接的另一核酸引入到細胞中的多核苷酸。一種類型的載體是“質粒”，其是指可以將另外的核酸區段連接到其中的線性或環狀雙鏈dna分子。另一種類型的載體是病毒載體(例如，復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)，其中另外的dna區段可以被引入到病毒基因組中。某些載體能夠在引入了它們的宿主細胞中自主復制(例如，包含細菌復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體(episomal?mammalianvector))。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)在引入到宿主細胞中后被整合到宿主細胞的基因組中，并且從而與宿主基因組一起復制。“表達載體”是可以指導選擇的多核苷酸的表達的一種類型的載體。“調控序列”是影響與其可操作地連接的核酸的表達(例如，表達的水平、時機或位置)的核酸。調控序列可以例如直接對被調控的核酸發揮其作用，或通過一種或更多種其他分子(例如，與調控序列和/或核酸結合的多肽)的作用發揮其作用。調控序列的實例包括啟動子、增強子和其他表達控制元件(例如，多腺苷酸化信號)。調控序列的另外的實例描述于例如goeddel,1990,gene?expression?technology:methods?in?enzymology?185,academic?press,san?diego；calif.和baron等人,1995,nucleic?acids?res.23:3605-06中。如果調控序列影響核苷酸序列的表達(例如，表達的水平、時機或位置)，則核苷酸序列與調控序列“可操作地連接”。“宿主細胞”是可以被用于表達本公開內容的多核苷酸的細胞。宿主細胞可以是原核生物，例如大腸桿菌(e.coli)，或者宿主細胞可以是真核生物，例如單細胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物細胞(例如，煙草或番茄植物細胞)、動物細胞(例如，人類細胞、猴細胞、倉鼠細胞、大鼠細胞、小鼠細胞或昆蟲細胞)或雜交瘤。通常，宿主細胞是可以用編碼多肽的核酸轉化或轉染的培養的細胞，所述核酸然后可以在宿主細胞中被表達。措辭“重組宿主細胞”可以被用于表示已經用待表達的核酸轉化或轉染的宿主細胞。宿主細胞還可以是包含核酸但不以期望的水平表達該核酸的細胞，除非調控序列被引入到宿主細胞中，使得調控序列變成與該核酸可操作地連接。應理解，術語宿主細胞不僅指特定的受試者細胞，而且還指這樣的細胞的后代或潛在后代。因為某些修飾可以由于例如突變或環境影響而在隨后世代中發生，這樣的后代實際上可能與親本細胞不相同，但仍然被包括在如本文使用的該術語的范圍內。術語“分離的分子”(其中分子是例如多肽或多核苷酸)是這樣的分子：該分子憑借其起源或衍生的來源(1)不與在其天然狀態中伴隨其的、天然地締合的組分締合，(2)基本上不含來自相同物種的其他分子，(3)由來自不同物種的細胞表達，或(4)不存在于自然界中。因此，化學合成的、或在與其天然起源的細胞不同的細胞系統中表達的分子將是與其天然締合的組分“分離”的。還可以利用本領域公知的純化技術通過分離使分子變成基本上不含天然締合的組分。分子純度或均一性可以通過本領域公知的很多方式來測定。例如，多肽樣品的純度可以使用本領域熟知的技術使用聚丙烯酰胺凝膠電泳和對凝膠染色以使多肽可視化來測定。為了某些目的，可以通過使用hplc或本領域熟知的用于純化的其他手段來提供更高的分辨率。當樣品的至少約60％至75％表現為單一種類的多肽時，蛋白或多肽是“基本上純的”、“基本上均一的”或“基本上純化的”。多肽或蛋白可以是單體的或多聚體的。基本上純的多肽或蛋白將通常包含約50％、60％、70％、80％或90％?w/w的蛋白樣品，更通常約95％并且優選地將超過99％純。蛋白純度或均一性可以通過本領域熟知的許多手段來指示，所述手段諸如蛋白樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后用本領域熟知的染色劑對凝膠進行染色后使單個多肽條帶可視化。為了某些目的，可以通過使用hplc或本領域熟知的用于純化的其他手段來提供更高的分辨率。如本文使用的術語“標記物(label)”或“標記的(labeled)”是指在抗體中摻入另一種分子。在一種實施方案中，標記物是可檢測的標志物，例如，摻入放射性標記的氨基酸或附接至可以通過標記的親和素檢測的生物素基部分的多肽(例如，包含熒光標志物的鏈霉親和素或可以通過光學方法或量熱法檢測的酶活性)。在另一種實施方案中，標記物或標志物可以是治療性的，例如，藥物綴合物或毒素。標記多肽和糖蛋白的多種方法是本領域中已知的并且可以被使用。用于多肽的標記物的實例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3h、14c、15n、35s、90y、99tc、111in、125i、131i)；熒光標記物(例如，fitc、羅丹明、鑭系元素熒光團)；酶標記物(例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶)；化學發光標志物；生物素基基團；由第二報告物識別的預定的多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈配對序列、第二抗體的結合位點、金屬結合結構域、表位標簽)；磁性劑(magneticagent)，諸如釓螯合物；毒素諸如百日咳毒素、紫杉醇、細胞松弛素b、短桿菌肽d、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春花堿、秋水仙堿、多柔比星、柔紅霉素、二羥基蒽二酮(dihydroxy?anthracin?dione)、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素d、1-去氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾(propranolol)和嘌呤霉素及其類似物或同系物。在各種實施方案中，標記物通過各種長度的間隔臂(spacer?arm)附接，以降低潛在的空間位阻。如本文使用的術語“異源”是指非天然的或在自然界不存在的組合或狀態，所述組合或狀態例如可以通過用源自另一來源的組分或狀態替換現有的天然組分或狀態來實現。類似地，在除了其中蛋白天然地表達的生物體之外的生物體中的蛋白表達構成異源表達系統和異源蛋白。應理解，本文描述的本公開內容的方面和實施方案包括“由這些方面和實施方案組成”和/或“主要由這些方面和實施方案組成”。本文中述及“約”值或參數包括(并且描述)針對該值或參數本身的變化。例如，述及“約x”的描述包括對“x”的描述。除非上下文另外明確規定，否則如本文和所附的權利要求中使用的單數形式“一”、“或”和“該”包括復數指代物。應理解，本文描述的本公開內容的方面和變化形式包括“由這些方面和變化形式組成”和/或“主要由這些方面和變化形式組成”。pd1阻斷抗體在一方面，pd1阻斷抗體將vitokine的il-2部分引導至腫瘤微環境(tme)中的til，并將vitokine的活化限制在局部以改善治療指數。在另一方面，pd1阻斷抗體將免疫細胞因子的il-2部分引導至tme中的til。在各種實施方案中，pd1阻斷抗體通過在帕博利珠單抗的可變結構域中的修飾來優化。在各種實施方案中，修飾涉及cdr殘基的種系序列取代、框架殘基的種系序列取代和采用最普遍且表現更好的vh3人類種系家族序列作為受體框架。在各種實施方案中，這些修飾單獨地或組合地實施以開發優化的pd1阻斷抗體。在各種實施方案中，這些優化的pd1阻斷抗體表現出對pd1的高結合親和力，以與帕博利珠單抗相同或相當的效力起抑制pd1的作用，與其最接近的人類種系序列具有更高的序列相似性評分，與帕博利珠單抗相比導致提高的人源性程度，并且預測具有較低的疏水性，導致比帕博利珠單抗降低的聚集傾向。在各種實施方案中，基于這些優化的pd1阻斷抗體的pd1?ab-il-2vitokine構建體和pd1靶向性il-2免疫細胞因子被預測具有增強的可開發性特性。在各種實施方案中，pd1抗體包含具有選自seq?id?no:3-5中列出序列的組的序列的輕鏈可變區和具有選自seq?id?no:7-18中列出序列的組的序列的重鏈可變區。在各種實施方案中，pd1抗體包含seq?id?no:44中列出的輕鏈序列和具有選自seq?id?no:45-49中列出序列的組的序列的重鏈。il-2結構域白介素-2(il-2)是一種經典的th1細胞因子，由t細胞通過t細胞抗原受體和共刺激分子cd28活化后產生。il-2的調節通過作用于il-2啟動子以產生新的基因轉錄的信號傳導途徑和轉錄因子的活化而發生，但也涉及對il-2mrna的穩定性的調節。il-2結合多鏈受體，包括通過jak-stat途徑介導信號傳導的高度調節的α鏈及β和γ鏈。il-2向t細胞、b細胞和nk細胞遞送活化、生長和分化信號。il-2在介導活化誘導的t細胞的細胞死亡中也很重要，這一功能為終止免疫應答提供了關鍵機制。一種商業上可獲得的未糖基化的人類重組il-2產品阿地白介素(可從prometheus?laboratories?inc.,san?diego?calif.以商標為的des-丙氨酰基-1,絲氨酸-125人類白介素-2獲得)，已被批準用于向罹患轉移性腎細胞癌和轉移性黑素瘤的患者施用。il-2還被建議用于在罹患或感染丙型肝炎病毒(hcv)、人類免疫缺陷病毒(hiv)、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、皮膚t細胞淋巴瘤、幼年類風濕性關節炎、特應性皮炎、乳腺癌和膀胱癌的患者中施用。不幸的是，短半衰期和嚴重毒性限制了il-2的最佳給藥。如本文使用的，術語“天然il-2”和“天然白介素-2”在蛋白或多肽的上下文中是指任何天然存在的哺乳動物白介素-2氨基酸序列，包括未成熟形式或前體形式和成熟形式。各個物種的天然哺乳動物白介素-2的氨基酸序列的genbank登錄號的非限制性實例包括np_032392.1(小家鼠(mus?musculus)，未成熟形式)、np_001040595.1(獼猴(macacamulatta)，未成熟形式)、np_000577.2(人類，前體形式)、caa01199.1(人類，未成熟形式)和aad48509.1(人類，未成熟形式)。在本發明的各種實施方案中，天然il-2是天然存在的哺乳動物il-2的未成熟或前體形式。在其他實施方案中，天然il-2是天然存在的哺乳動物il-2的成熟形式。在各種實施方案中，天然il-2是天然存在的人類il-2的前體形式。在各種實施方案中，天然il-2是天然存在的人類il-2的成熟形式。在各種實施方案中，本發明的vitokine和免疫細胞因子構建體中的il-2源自seq?id?no:116中列出的人類il-2成熟序列的氨基酸序列：aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiistlt(seq?id?no:116)在各種實施方案中，il-2結構域將是il-2變體(或突變體)，包含源自如seq?idno:116中列出的成熟的人類il-2多肽序列的序列。在各種實施方案中，il-2變體包含單一c125i氨基酸取代，其通用地增強蛋白質的可開發性，同時完全保留其生物活性。在各種實施方案中，包含單個c125i突變的il-2變體具有seq?id?no:117中列出的氨基酸序列。在各種實施方案中，與天然il-2序列相比，il-2變體的序列具有至少一個氨基酸變化，例如，取代或缺失，這樣的變化導致il-2激動劑或拮抗劑活性。il-2激動劑通過與野生型il-2相比生物活性相當或增加來例示。il-2拮抗劑通過與野生型il-2相比生物活性降低或通過抑制il-2介導的響應的能力來例示。在各種實施方案中，il-2變體具有源自seqid?no:117的具有改變的與il-2rα結合的氨基酸序列。在各種實施方案中，具有改變的與il-2rα結合的il-2變體包含seq?id?no:118-125中列出的氨基酸序列。在各種實施方案中，il-2變體具有源自seq?id?no:117的具有減少/消除的與il-2rα結合的氨基酸序列，以選擇性地活化并增殖效應t細胞(teff)，用于治療癌癥。在各種實施方案中，具有減少/消除的與il-2rα結合的il-2變體包含seq?id?no:118-122中列出的氨基酸序列。在各種實施方案中，il-2變體具有源自seq?id?no:117的具有減少的與il-2rβ和/或γc結合的氨基酸序列。在各種實施方案中，降低與il-2rβ和/或γc的結合的il-2變體包含seq?id?no:126-150中列出的氨基酸序列。在各種實施方案中，il-2變體具有源自seq?id?no:117的具有減少/消除的與il-2rα結合的和減少的與il-2rβ和/或γc結合的氨基酸序列。在各種實施方案中，具有減少/消除的與il-2rα結合的和減少的與il-2rβ和/或γc結合的il-2變體包含seq?idno:151-180中列出的氨基酸序列。如本領域技術人員將理解的，所有的突變可以任選地和獨立地以任何方式組合，以實現最佳的親和力和活性調節。il-2rα結構域(pd1?ab-il-2?vitokine中的遮蔽部分結構域)il-2受體(il-2r)是一種在某些免疫細胞諸如淋巴細胞的表面上表達的異源三聚體蛋白，結合并響應于il-2。il-2r具有三個亞基：α(cd25)、β(cd122)和γ(cd132或共同γ鏈(γc))，這是與其他五種細胞因子受體il-4r、il-7r、il-9r、il-15r和il-21r共有的鏈。人類受體的α鏈(別名：tac抗原或p55)由染色體10p14-15上的基因il-2ra編碼。人類受體的β鏈(il-2rb，cd122)的基因位于染色體22q11.2-12上，而人類γ鏈(il-2rg)的基因位于染色體xq13上。受體的所有三個亞基的組裝對于信號轉導進入b細胞和t細胞是重要的。il-2r存在(暫時或永久地)于幾乎所有造血細胞(包括淋巴譜系t、b和nk細胞，以及髓性細胞，如巨噬細胞、單核細胞和中性粒細胞)的細胞表面上。信號經由janus激酶—jak1和jak3傳遞到細胞中。受體的β鏈的胞質內部分的磷酸化使得stat-3和stat-5因子能夠形成同源二聚體。stat-3和stat-5的同源二聚體顯示出增加的對細胞核的親和力，在細胞核中它們與特定的dna元件結合，增強il-2依賴性基因的轉錄。如本文使用的，術語“天然il-2rα”和“天然白介素-2受體α”在蛋白或多肽的上下文中是指任何天然存在的哺乳動物白介素-2受體α(“il-2rα”)氨基酸序列，包括未成熟形式或前體形式和成熟形式以及天然存在的同種型。多種天然哺乳動物il-2rα的氨基酸序列的genbank登錄號的非限制性實例包括np_032393.3(小家鼠)、cak26553.1(人類)和np_000408.1(人類)。在各種實施方案中，il-2rα結構域源自seq?id?no:181中列出的人類il-2rα序列的氨基酸序列：mdsyllmwglltfimvpgcqaelcdddppeiphatfkamaykegtmlnceckrgfrriksgslymlctgnsshsswdnqcqctssatrnttkqvtpqpeeqkerkttemqspmqpvdqaslpghcrepppweneateriyhfvvgqmvyyqcvqgyralhrgpaesvckmthgktrwtqpqlictgemetsqfpgeekpqaspegrpesetsclvtttdfqiqtemaatmetsiftteyqvavagcvfllisvlllsgltwqrrqrksrrti(seq?id?no:181)在各種實施方案中，遮蔽部分結構域(d3)用于可逆地遮蔽pd1?ab-il-2?vitokine構建體中il-2結構域的活性。在各種實施方案中，遮蔽部分結構域是il-2rα細胞外結構域或其功能片段。在各種優選實施方案中，遮蔽部分結構域是il-2rαsushi結構域，其包含如seq?id?no:182中列出的成熟人類il-2rα多肽的氨基酸序列。在各種優選實施方案中，遮蔽部分結構域是il-2rαsushi結構域的變體。elcdddppeiphatfkamaykegtmlnceckrgfrriksgslymlctgnsshsswdnqcqctssatrnttkqvtpqpeeqkerkttemqspmqpvdqaslpghcrepppweneateriyhfvvgqmvyyqcvqgyralhrgpaesvckmthgktrwtqpqlictg(seq?id?no:182)在各種實施方案中，pd1?ab-il-2?vitokine包含il-2rαsushi(seq?id?no:182)作為遮蔽部分結構域以遮蔽il-2(包括il-2變體)活性。雖然野生型il-2rα以30nm的中等親和力與il-2結合，但在裂解接頭時，il-2rα仍有可能性可能不會解離。裂解的il-2rα和il-2之間的締合可以降低il-2的活性和/或t細胞亞群的平衡向不期望的結果的傾斜。隨著親和力降低突變被引入il-2rαsushi中，當接頭裂解時，il-2rαsushi結構域可能從il-2解離離開。在各種實施方案中，pd1?ab-il-2?vitokine中的遮蔽部分結構域是包含il-2結合減弱突變，例如，r36a、k38e、l42g或y43a，或取代的任何組合的il-2rαsushi變體。在各種實施方案中，il-2rαsushi變體可以有效地遮蔽il-2部分結構域的活性，盡管其對il-2的親和力降低。在各種實施方案中，由于il-2rαsushi變體對il-2的親和力降低，預期il-2rαsushi變體在接頭裂解時從il-2解離并擴散離開。在各種實施方案中，本發明的pd1?ab-il-2?vitokine構建體包含遮蔽部分結構域，該遮蔽部分結構域是包含如seq?id?no:183-185中列出的氨基酸序列的il-2rαsushi結構域變體之一。pd1?ab-il-2?vitokine中的l1接頭和l2接頭可裂解的接頭可裂解的接頭或對疾病相關酶易感的接頭可以包含部分，例如蛋白底物，其能夠被與非疾病組織相比在疾病部位處以升高的水平存在的蛋白酶特異性地裂解。文獻含有關于在各種類型的癌癥(例如，實體瘤)中具有已知底物的酶水平增加的多份報告。參見例如，la?rocca等人,brit.j.cancer?90:1414-1421和ducry等人,bioconjug.chem.21:5-13,2010，其中每篇文獻通過引用以其整體并入本文。在各種實施方案中，能夠裂解蛋白酶可裂解接頭的蛋白酶選自由以下組成的組：金屬蛋白酶例如基質金屬蛋白酶(mmp)1-28、絲氨酸蛋白酶例如尿激酶型纖溶酶原激活物(upa)和matriptase、半胱氨酸蛋白酶例如豆莢蛋白、天冬氨酸蛋白酶以及組織蛋白酶蛋白酶。表2中提供了示例性蛋白酶：表2可用作具有或不具有肽間隔物的蛋白酶可裂解接頭的示例性蛋白酶底物肽序列如表3中提供：表3在各種實施方案中，蛋白酶是mmp-9或mmp-2。在另外的特定實施方案中，蛋白酶是matriptase。在另外的特定實施方案中，蛋白酶是mmp-14。在另外的特定實施方案中，蛋白酶是豆莢蛋白。在各種實施方案中，蛋白酶可裂解接頭可含有兩個或更多個蛋白酶底物序列。在各種實施方案中，蛋白酶是mmp-2/mmp-9和matriptase。在各種實施方案中，蛋白酶可裂解的接頭包含蛋白酶識別序列‘gplgmlsq’(seq?id?no:61)。在各種實施方案中，蛋白酶可裂解的接頭包含蛋白酶識別序列‘sgrsenirta’(seq?id?no:60)。在各種實施方案中，蛋白酶可裂解的接頭包含蛋白酶識別序列‘gptnkvr’(seq?id?no:69)。在各種實施方案中，蛋白酶可裂解的接頭包含蛋白酶識別序列‘pmakk’(seq?id?no:74)。在各種實施方案中，蛋白酶可裂解的接頭包含蛋白酶識別序列‘gplgmlsqpmakk’(seq?id?no:76)。在各種實施方案中，蛋白酶可裂解的接頭包含蛋白酶識別序列‘pmakkgplgmlsq’(seq?id?no:77)。在各種實施方案中，肽間隔物可以被摻入蛋白酶可裂解序列的任一側或蛋白酶可裂解序列的兩側，或者作為不具有蛋白酶底物位點的不可裂解接頭。肽間隔物用于定位可裂解接頭，使其更容易接近于負責裂解的酶。可以微調肽間隔物的長度和構成，以平衡酶促裂解的可及性和可逆地遮蔽d2結構域以使其不發揮其生物活性所需的空間限制。肽間隔物可以包括1個-100個氨基酸。合適的肽間隔物是本領域已知的，其包括但不限于含有柔性氨基酸殘基諸如甘氨酸和絲氨酸的肽接頭。在各種實施方案中，肽間隔物可以包含1個至12個氨基酸，包括基序g、s、gsgg(seq?id?no:104)、ggss(seq?id?no:105)、gsgs(seq?id?no:109)、gsgsgs(seq?id?no:110)、gsgsgsgs(seq?id?no:111)、gsgsgsgsgs(seq?id?no:112)或gsgsgsgsgsgs(seq?id?no:113)。在其他實施方案中，肽間隔物可以包含基序(ggggs)(seq?id?no:106)n，其中n是1至10的整數。在其他實施方案中，肽間隔物還可以包含除甘氨酸和絲氨酸之外的氨基酸。肽間隔物在生理條件下以及在患病部位處，諸如癌癥部位是穩定的。在表4中提供了示例性蛋白酶可裂解接頭，其具有蛋白酶底物肽(加下劃線)的側翼的肽間隔物：表4 蛋白酶可裂解接頭 seq?id?no: <![cdata[gggsggggsggggs<u>lsgrsdnh</u>ggsggggs]]> 78 <![cdata[gss<u>sgrsenirta</u>gt]]> 79 <![cdata[ggggsggggsgggs<u>lggsgrsanaile</u>ggsggggs]]> 80 <![cdata[ggggsggggs<u>lggsgrsanaile</u>ggggs]]> 81 <![cdata[ggggs<u>lggsgrsanaile</u>ggs]]> 82 <![cdata[gggs<u>gptnkvr</u>ggs]]> 83 <![cdata[ggs<u>gplgmlsq</u>gggs]]> 84 <![cdata[g<u>gplgmlsq</u>s]]> 85 <![cdata[gg<u>gplgmlsq</u>ggs]]> 86 <![cdata[g<u>gptnkvr</u>gs]]> 87 <![cdata[g<u>rqaravgg</u>s]]> 88 <![cdata[ggg<u>sgrsenirta</u>gg]]> 89 <![cdata[sggp<u>gpagmkgl</u>pgs]]> 90 <![cdata[ggggs<u>pmakk</u>ggggs]]> 91 <![cdata[g<u>gplgmlsqpmakk</u>s]]> 92 <![cdata[ggs<u>gplgmlsqpmakk</u>gggs]]> 93 <![cdata[ggg<u>pmakkgplgmlsq</u>gggs]]> 94 不可裂解的接頭不可裂解的接頭在蛋白結構域之間提供共價連接和另外的結構和/或空間柔性。如本領域中已知的，含有柔性氨基酸殘基諸如甘氨酸和絲氨酸的肽接頭可用作不可裂解的接頭。在各種實施方案中，不可裂解的接頭可以包含1個-100個氨基酸。在各種實施方案中，間隔物可以包含基序gsgg(seq?id?no:104)、ggss(seq?id?no:105)、gsgs(seq?id?no:109)、gsgsgs(seq?id?no:110)、gsgsgsgs(seq?id?no:111)、gsgsgsgsgs(seq?id?no:112)或gsgsgsgsgsgs(seq?id?no:113)。在其他實施方案中，間隔物可以包含基序(ggggs)(seqid?no:106)n，其中n是1至10的整數。在其他實施方案中，接頭還可以包含除甘氨酸和絲氨酸之外的氨基酸。在另一種實施方案中，不可裂解的接頭可以是簡單的化學鍵，例如酰胺鍵(例如通過peg的化學綴合)。不可裂解的接頭在生理條件下以及在患病部位處，諸如癌癥部位是穩定的。在表5中提供了示例性的不可裂解的接頭：表5可裂解和不可裂解的接頭的組合在各種實施方案中，l1接頭和l2接頭兩者可以都是可裂解的或是可裂解的接頭和不可裂解的接頭的組合，以產生il-2結構域的不同形式的活性部分，以實現特定的治療目標，優化風險與收益比，或與細胞因子的不同特性對齊。通過接頭裂解而釋放的示例性活性形式在圖2中描繪。源自l1接頭裂解的活性形式1和源自l1接頭和l2接頭裂解的活性形式3兩者都是短效細胞因子，這是由于它們在蛋白水解后從靶向抗體釋放。遮蔽結構域的存在或不存在將導致這兩種活性形式在局部環境中的不同活性。在局部作用后，短效活性形式可以從體循環中快速消除，導致減少毒性。相反，源自l2接頭裂解的活性形式2(圖2中描繪)是在疾病部位處或疾病部位附近與pd1?ab融合的功能完全恢復的il-2。這種活性形式能夠在疾病部位處或疾病部位附近順式激活表達pd1的t細胞上的il-2r信號傳導，其協同地增強兩種途徑并加強抗癌免疫應答，同時最小化全身毒性。多核苷酸在另一方面，本公開內容提供了分離的核酸分子，其包含本公開內容的il-2、il-2變體、il-2rα、il-2rα變體、pd1阻斷抗體、抗體片段、pd1?ab-il-2?vitokine構建體或pd1靶向性il-2免疫細胞因子的多核苷酸。該子部分(sub-section)“多核苷酸”的后續段落將利用pd1靶向性il-2?vitokine(vitokine)構建體作為說明性實例，然而這些概念應同樣適用于本發明的pd1靶向性il-2免疫細胞因子。主題核酸可以是單鏈的或雙鏈的。這樣的核酸可以是dna或rna分子。dna包括例如cdna、基因組dna、合成的dna、通過pcr擴增的dna及其組合。編碼vitokine構建體的基因組dna獲取自基因組文庫，該基因組文庫對許多物種是可得的。合成的dna從化學合成重疊的寡核苷酸片段然后組裝片段以重構編碼區和側翼序列的部分或全部而可獲得。rna可以從指導高水平合成mrna的原核表達載體(諸如使用t7啟動子和rna聚合酶的載體)獲得。本公開內容的dna分子包括全長基因以及多核苷酸及其片段。全長基因還可以包含編碼n末端信號序列的序列。此類核酸可以例如在用于制備新的vitokine構建體的方法中使用。在各種實施方案中，分離的核酸分子包含本文描述的多核苷酸，并且還包含編碼本文描述的至少一種異源蛋白的多核苷酸。在各種實施方案中，核酸分子還包含編碼本文描述的接頭或鉸鏈接頭的多核苷酸。在各種實施方案中，本公開內容的重組核酸可以可操作地連接至表達構建體中的一種或更多種調控核苷酸序列。調控序列是本領域所認知的并且被選擇以指導vitokine構建體的表達。相應地，術語調控序列包括啟動子、增強子和其他表達控制元件。在goeddel；gene?expression?technology:methods?in?enzymology,academic?press,san?diego,calif.(1990)中描述了示例性的調控序列。通常，所述一種或更多種調控核苷酸序列可以包括但不限于啟動子序列、前導或信號序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列、以及增強子或激活序列。本公開內容設想了本領域已知的組成型或誘導型啟動子。啟動子可以是天然存在的啟動子或者組合多于一個啟動子的元件的雜合啟動子。表達構建體可以存在于細胞中的附加體諸如質粒上，或者表達構建體可以插入染色體中。在各種實施方案中，表達載體包含可選擇的標志物基因以允許選擇轉化的宿主細胞。可選擇的標志物基因是本領域熟知的并且將隨著使用的宿主細胞變化。在本公開內容的另一方面，在包含編碼vitokine構建體并可操作地連接到至少一個調控序列的核苷酸序列的表達載體中提供主題核酸。術語“表達載體”是指用于從多核苷酸序列表達多肽的質粒、噬菌體、病毒或載體。適于在宿主細胞中表達的載體是容易地可得的并利用標準重組dna技術將核酸分子插入到載體中。此類載體可以包括很多種表達控制序列，當被可操作地連接至dna序列時，所述表達控制序列控制該dna序列的表達，并可以在這些載體中使用以表達編碼vitokine構建體的dna序列。此類有用的表達控制序列包括，例如，sv40的早期啟動子和晚期啟動子、tet啟動子、腺病毒或巨細胞病毒介導的早期啟動子、rsv啟動子、lac系統、trp系統、tac或trc系統、其表達由t7?rna聚合酶指導的t7啟動子、λ噬菌體的主要操縱子和啟動子區域、fd外殼蛋白的控制區域、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的啟動子、酸性磷酸酶例如phos的啟動子、酵母a-交配因子的啟動子、桿狀病毒系統的多角體啟動子和已知控制原核細胞或真核細胞或其病毒的基因表達的其他序列及其各種組合。應理解，表達載體的設計可能取決于諸如待轉化的宿主細胞的選擇和/或期望表達的蛋白的類型的因素。此外，還應考慮載體的拷貝數、控制該拷貝數的能力、以及載體編碼的任何其他蛋白諸如抗生素標志物的表達。適用于vitokine的表達的示例性表達載體是包含vitokine多核苷酸的pdsra及其衍生物，以及本領域已知的或下文描述的任何另外的合適的載體。本公開內容的重組核酸可以通過將克隆的基因或其一部分連接到適于在原核細胞、真核細胞(酵母、鳥類、昆蟲或哺乳動物)或兩者中表達的載體中來產生。用于產生重組vitokine構建體的表達媒介物包括質粒和其他載體。例如，合適的載體包括以下類型的質粒：用于在原核細胞諸如大腸桿菌中表達的pbr322衍生的質粒、pembl衍生的質粒、pex衍生的質粒、pbtac衍生的質粒和puc衍生的質粒。一些哺乳動物表達載體包含利于載體在細菌中增殖的原核序列以及在真核細胞中表達的一種或更多種真核轉錄單元兩者。pcdnai/amp、pcdnai/neo、prc/cmv、psv2gpt、psv2neo、psv2-dhfr、ptk2、prsvneo、pmsg、psvt7、pko-neo和phyg衍生的載體為適于轉染真核細胞的哺乳動物表達載體的實例。這些載體中的一些被來自細菌質粒諸如pbr322的序列修飾，以利于在原核細胞和真核細胞兩者中復制和藥物抗性選擇。可選地，病毒諸如牛乳頭瘤病毒的衍生物(bpv-1)或epstein-barr病毒的衍生物(phebo、prep衍生的和p205)可以用于蛋白在真核細胞中的瞬時表達。其他病毒(包括逆轉錄病毒)表達系統的實例可見于下文基因療法遞送系統的描述中。在質粒的制備方面和宿主生物體的轉化方面所采用的各種方法是本領域熟知的。對于適于原核細胞和真核細胞兩者的其他表達系統以及一般的重組程序，參見sambrook、fritsch和maniatis的molecular?cloning?a?laboratory?manual,第2版(cold?spring?harbor?laboratory?press,1989)第16和17章。在一些情形下，可能期望通過使用桿狀病毒表達系統來表達重組多肽。此類桿狀病毒表達系統的實例包括pvl衍生的載體(諸如pvl1392、pvl1393和pvl941)、pacuw衍生的載體(諸如pacuw1)以及pbluebac衍生的載體(諸如含有b-gal的pbluebac?iii)。在各種實施方案中，將設計用于在中國倉鼠卵巢(cho)細胞或人類胚胎腎293(hek293)細胞中產生主題vitokine構建體的載體，諸如pcmv-script載體(stratagene,lajolla,calif.)、pcdna4載體(invitrogen,carlsbad,calif.)和pci-neo載體(promega,madison,wis.)。將明顯的是，主題基因構建體可以被用于引起主題vitokine構建體在增殖于培養基中的細胞中表達，例如以產生用于純化的蛋白，包括融合蛋白或變體蛋白。本公開內容還涉及用重組基因轉染的宿主細胞，所述重組基因包含編碼一種或更多種主題vitokine構建體的氨基酸序列的核苷酸序列。宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞。例如，本公開內容的vitokine構建體可以在細菌細胞諸如大腸桿菌、昆蟲細胞(例如，使用桿狀病毒表達系統)、酵母或哺乳動物細胞中表達。其他合適的宿主細胞是本領域技術人員已知的，諸如cho細胞或hek293細胞。相應地，本公開內容還涉及產生主題vitokine構建體的方法。例如，可以在允許發生vitokine構建體的表達的適當條件下培養用編碼vitokine構建體的表達載體轉染的宿主細胞。vitokine構建體可以從含有vitokine構建體的細胞和培養基的混合物分泌和分離。可選地，vitokine構建體可以保留在細胞質中或保留在膜級分中，并收獲、裂解細胞和分離蛋白。細胞培養物包括宿主細胞、培養基和其他副產物。用于細胞培養的合適培養基是本領域熟知的。本公開內容的多肽和蛋白可以根據本領域技術人員所熟知的蛋白純化技術來純化。這些技術在一個層面上包括蛋白級分和非蛋白級分的粗分級。已經將肽或多肽與其他蛋白分離后，可以利用色譜技術和電泳技術進一步純化感興趣的肽或多肽，以實現部分或完全純化(或純化至均一)。如本文使用的術語“分離的多肽”或“純化的多肽”意圖指可與其他組分分離的組合物，其中多肽被純化至相對于其天然可獲得狀態的任何程度。因此純化的多肽還指脫離其可能天然存在的環境的多肽。通常，“純化的”將指已經經歷分級以去除多種其他組分的多肽組合物，并且該多肽組合物基本上保留了其表達的生物活性。當使用術語“基本上純化的”時，該指定將指這樣的肽或多肽組合物，其中多肽或肽形成組合物的大部分組分，諸如構成組合物中的蛋白的約50％、約60％、約70％、約80％、約85％或約90％或更多。適合用于純化的各種技術對于本領域技術人員將是熟知的。這些技術包括例如用硫酸銨、peg、抗體(免疫沉淀)等或通過熱變性沉淀然后離心；層析，諸如親和層析(蛋白-a柱)、離子交換、凝膠過濾、反相、羥基磷灰石、疏水相互作用層析；等電聚焦；凝膠電泳；以及這些技術的組合。如本領域一般已知的，認為進行多種純化步驟的順序可以改變，或者某些步驟可以省略，并且仍得到用于制備基本上純化的多肽的合適方法。藥物組合物本子部分“藥物組合物”的后續段落將利用pd1靶向性il-2?vitokine(vitokine)構建體作為說明性實例，然而這些概念應同樣適用于本發明的pd1靶向性il-2免疫細胞因子。在另一方面，本公開內容提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含與藥學上可接受的運載體混合的vitokine構建體。此類藥學上可接受的運載體是本領域普通技術人員所熟知并理解的，并且已被廣泛描述(參見例如，remington’s?pharmaceutical?sciences,第18版,a.r.gennaro編著,mack?publishing?company,1990)。可以包括藥學上可接受的運載體以用于改變、保持或維持，例如，ph、摩爾滲透壓濃度、黏度、澄清度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、組合物的吸收或滲透的目的。這樣的藥物組合物可以影響多肽的物理狀態、穩定性、體內釋放速率以及體內清除速率。合適的藥學上可接受的運載體包括但不限于，氨基酸(諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸)；抗菌劑；抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩沖劑(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、tris-hcl、檸檬酸鹽、磷酸鹽、其他有機酸)；膨脹劑(諸如甘露醇或甘氨酸)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(edta))；復合劑(complexing?agent)(諸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)；填料；單糖；二糖和其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑；調味劑和稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；鹽形成抗衡離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如苯扎氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露醇或山梨醇)；懸浮劑；表面活性劑或潤濕劑(諸如普朗尼克、peg、山梨醇酐酯(sorbitan?esters)、聚山梨醇酯諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、曲拉通(triton)、氨丁三醇、卵磷脂、膽固醇、tyloxapal)；穩定性增強劑(蔗糖或山梨醇)；張度增強劑(諸如堿金屬鹵化物(優選氯化鈉或氯化鉀)、甘露醇和山梨醇)；遞送媒介物；稀釋劑；賦形劑和/或藥物佐劑。藥物組合物中的主要媒介物或運載體實質上可以是水性的或非水性的。例如，合適的媒介物或運載體可以是可能用用于腸胃外施用的組合物中常見的其他材料補充的注射用水、生理鹽水溶液或人工腦脊液。中性緩沖鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是另外的示例性媒介物。其他的示例性藥物組合物包含約ph?7.0-8.5的tris緩沖液或約ph?4.0-5.5的乙酸鹽緩沖液，其還可以包含山梨醇或其合適的替代物。在本公開內容的一種實施方案中，可以通過將選擇的具有期望程度的純度的組合物與任選的制劑用劑(formulationagent)(remington’spharmaceutical?sciences,同上)混合來制備組合物以便以凍干的塊狀物或水性溶液形式儲存。另外，可以使用合適的賦形劑諸如蔗糖將治療組合物配制為凍干物。最佳的藥物組合物將取決于例如意圖的施用途徑、遞送形式和期望的劑量由本領域普通技術人員確定。當設想腸胃外施用時，治療性藥物組合物可以呈在藥學上可接受的媒介物中包含期望的vitokine構建體的無致熱原、腸胃外可接受的水性溶液的形式。用于腸胃外注射的特別合適的媒介物是無菌蒸餾水，其中多肽被配制為合適儲存的無菌、等滲溶液。在各種實施方案中，適于可注射施用的藥物制劑可以在水性溶液，優選地在生理上相容的緩沖液諸如hanks溶液、ringer溶液或生理緩沖鹽水中配制。水性注射懸浮液可以包含增加懸浮液黏度的物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或右旋糖酐。此外，活性化合物的懸浮液可以被制備為合適的油性注射懸浮液。任選地，懸浮液還可以包含合適的穩定劑或增加化合物的溶解度并允許制備高度濃縮的溶液的劑。在各種實施方案中，可以使用膠體分散系統將治療性藥物組合物配制為用于靶向遞送。膠體分散系統包括大分子復合體、納米膠囊、微球、珠、和基于脂質的系統，基于脂質的系統包括水包油乳液、膠束、混合的膠束和脂質體。在脂質體產生中有用的脂質的實例包括磷脂酰化合物，諸如磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷酯酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、腦苷脂和神經節苷脂。示例性磷脂包括卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿。脂質體的靶向還可以基于例如器官特異性、細胞特異性和細胞器特異性并且是本領域已知的。在各種實施方案中，設想了藥物組合物的口服施用。以該形式施用的藥物組合物可以使用或不使用固體劑型諸如片劑和膠囊的復合中通常使用的那些運載體配制。在用于口服施用的固體劑型(膠囊、片劑、丸劑、糖衣丸、粉末、顆粒等)中，本公開內容的一種或更多種治療化合物可以與一種或更多種藥學上可接受的運載體諸如檸檬酸鈉或磷酸氫鈣(dicalcium?phosphate)和/或以下中的任一種混合：(1)填料或增量劑(extender)，諸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合劑，諸如例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯樹膠；(3)保濕劑，諸如甘油；(4)崩解劑，諸如瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；(5)溶液阻滯劑，諸如石蠟；(6)吸收加速劑，諸如季銨化合物；(7)潤濕劑，諸如例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(8)吸收劑，諸如高嶺土和膨潤土；(9)潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉及其混合物；以及(10)著色劑。在膠囊、片劑和丸劑的情況下，藥物組合物還可以包含緩沖劑。相似類型的固體組合物還可以用作使用諸如乳糖(lactose)或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等的賦形劑軟填充和硬填充的明膠膠囊中的填料。用于口服施用的液體劑型包括藥學上可接受的乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿劑和酏劑。除了活性成分之外，液體劑型可以含有本領域常用的惰性稀釋劑，諸如水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特別地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀釋劑之外，口服組合物還可以包含輔料，諸如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、調味劑、著色劑、增香劑和防腐劑。在各種實施方案中，設想了將藥物組合物局部施用(topical?administration)至皮膚或施用至黏膜。局部制劑還可以包含已知作為皮膚或角質層滲透增強劑有效的很多種劑中的一種或更多種。這些劑的實例是2-吡咯烷酮、n-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇、甲醇或異丙醇、二甲基亞砜和氮酮。還可以包含另外的劑以使制劑在化妝品上可接受。這些劑的實例是脂肪、蠟、油、染料、芳香劑、防腐劑、穩定劑和表面活性劑。還可以包含角質軟化劑(keratolytic?agent)，諸如本領域已知的那些角質軟化劑。實例是水楊酸和硫磺。用于局部或經皮施用的劑型包括粉末、噴霧劑、軟膏劑(ointments)、糊劑、霜劑(creams)、洗劑、凝膠、溶液、貼劑和吸入劑。可以在無菌條件下將活性化合物與藥學上可接受的運載體以及與可能需要的任何防腐劑、緩沖劑或噴射劑混合。除了本公開內容的主題化合物(例如，vitokine構建體)之外，軟膏劑、糊劑、霜劑和凝膠可以包含賦形劑，諸如動物和植物脂肪、油、蠟、石蠟、淀粉、黃芪膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤土、硅酸、滑石和氧化鋅或其混合物。本文中設想的用于使用的另外的藥物組合物包括在持續遞送或控制遞送的制劑中包含多肽的制劑。在各種實施方案中，藥物組合物可以被配制成納米顆粒、作為緩釋水凝膠或摻入溶瘤病毒中。這樣的納米顆粒方法包括，例如，包封在包含作為藥物運載體的具有疏水主鏈和親水支鏈的聚合物的納米顆粒中，包封在微米顆粒中，以乳劑插入到脂質體中，以及與其他分子綴合。納米顆粒的實例包括用殼聚糖和卡波姆包衣的粘膜粘附性(mucoadhesive)納米顆粒(takeuchi等人,adv.drug?deliv.rev.47(1):39-54,2001)及包含帶電荷的組合聚酯、聚(2-磺丁基-乙烯醇)和聚(d,l-乳酸-羥基乙酸共聚物)(poly(d,l-lactic-co-glycolic?acid))的納米顆粒(jung等人，eur.j.pharm.biopharm.50(1):147-160,2000)。基于白蛋白的納米顆粒組合物已被開發為用于遞送疏水性藥物諸如紫杉烷的藥物遞送系統。參見例如美國專利第5,916,596號；第6,506,405號；第6,749,868號；第6,537,579號；第7,820,788號；和第7,923,536號。(白蛋白穩定的紫杉醇納米顆粒制劑)于2005年在美國獲得批準，并隨后在其他多個國家獲得批準，用于治療轉移性乳腺癌。用于配制多種其他持續遞送或控制遞送工具諸如脂質體運載體、生物可侵蝕的微粒或多孔珠和貯庫型注射劑的技術也是本領域技術人員已知的。待被治療上使用的藥物組合物的有效量將取決于例如治療背景和治療目標。本領域技術人員將理解，用于治療的適當劑量水平將因此部分地取決于所遞送的分子、多肽所用于的適應癥、施用途徑、以及患者的尺寸(體重、體表或器官尺寸)和狀況(年齡和總體健康)而變化。相應地，臨床醫師可以調整劑量并改變施用途徑以獲得最佳治療效果。典型的劑量可以取決于上文提及的因素而在從約0.0001mg/kg至最多約100mg/kg或更多的范圍內。多肽組合物可以優選地注射或靜脈內施用。取決于特定制劑的半衰期和清除率，長效藥物組合物可以每三至四天、每周、每兩周、每三周、每月或甚至更長的持續時間施用。給藥頻率將取決于使用的制劑中的多肽的藥代動力學參數。通常，施用組合物直至達到實現期望的效果的劑量。因此組合物可以作為單劑量或作為隨時間的多劑量(以相同或不同的濃度/劑量)或作為持續的輸注施用。常規地進行適當劑量的進一步改進。適當的劑量可以通過使用適當的劑量-響應數據來確定。藥物組合物的施用途徑根據已知方法，例如口服；通過靜脈內、腹膜內、瘤內、腦內(實質內)、腦室內、肌內、眼內、動脈內、門靜脈內、病灶內途徑，髓內、鞘內、心室內、囊泡內、經皮、皮下或腹膜內注射；以及鼻內、腸內、局部、舌下、尿道、陰道或直腸方式；通過持續釋放系統或通過植入裝置。當期望時，組合物可以通過團注(bolus)注射施用，或通過輸注持續施用，或通過植入裝置施用。可選地或另外地，組合物可以經由期望的分子已經吸附或包封至其上的膜、海綿狀物或另一種適當的材料的植入局部施用。當使用植入裝置時，可以將該裝置植入到任何合適的組織或器官中，并且期望的分子的遞送可以經由擴散施用、緩釋團注或持續施用。治療用途本子部分“治療用途”的后續段落將利用pd1靶向性il-2?vitokine(vitokine)構建體作為說明性實例，然而這些概念應同樣適用于本發明的pd1靶向性il-2免疫細胞因子。本公開內容提供了治療受試者的癌細胞的方法，包括向所述受試者施用藥學上可接受的運載體中的治療有效量(作為單一療法或在組合療法方案中)的本公開內容的vitokine構建體，其中此類施用抑制癌細胞的生長和/或增殖。特別地，本公開內容的vitokine構建體在治療以癌癥為特征的紊亂中是有用的。此類紊亂包括但不限于實體瘤，諸如乳腺癌、呼吸道癌、腦癌、生殖器官的癌癥、消化道的癌癥、尿道的癌癥、眼癌、肝癌、皮膚癌、頭頸癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌以及它們的遠端轉移，淋巴瘤，肉瘤，多發性骨髓瘤和白血病。乳腺癌的實例包括但不限于侵襲性導管癌、侵襲性小葉癌、原位導管癌和原位小葉癌。呼吸道的癌癥的實例包括但不限于小細胞肺癌和非小細胞肺癌，以及支氣管腺瘤和胸膜肺母細胞瘤(pleuropulmonary?blastoma)。腦癌的實例包括但不限于腦干和下丘腦膠質瘤、小腦和大腦星形細胞瘤、神經母細胞瘤、髓母細胞瘤、室管膜瘤以及神經外胚層和松果體腫瘤。雄性生殖器官的腫瘤包括但不限于前列腺癌和睪丸癌。雌性生殖器官的腫瘤包括但不限于子宮內膜癌、宮頸癌、卵巢癌、陰道癌和外陰癌以及子宮的肉瘤。消化道的腫瘤包括但不限于肛門癌、結腸癌、結腸直腸癌、食管癌、膽囊癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、直腸癌、小腸癌和唾液腺癌。尿道的腫瘤包括但不限于膀胱癌、陰莖癌、腎癌、腎盂癌、輸尿管癌和尿道癌。眼癌包括但不限于眼內黑素瘤和視網膜胚細胞瘤。肝癌的實例包括但不限于肝細胞癌(具有或不具有纖維板層變體的肝細胞癌)、膽管癌(肝內膽管癌)和混合性肝細胞膽管癌。皮膚癌包括但不限于鱗狀細胞癌、卡波濟氏肉瘤(kaposi’s?sarcoma)、惡性黑素瘤、梅克爾細胞癌(merkel?cell?skin?cancer)和非黑素瘤皮膚癌。頭頸癌包括但不限于鼻咽癌以及唇和口腔癌。淋巴瘤包括但不限于aids相關淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin’s?lymphoma)、皮膚t細胞淋巴瘤、霍奇金病(hodgkin’s?disease)和中樞神經系統淋巴瘤。肉瘤包括但不限于軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、淋巴肉瘤和橫紋肌肉瘤。白血病包括但不限于急性髓性白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、慢性髓細胞性白血病和毛細胞白血病。在各種實施方案中，vitokine構建體可用作治療所有種類癌癥的單一劑，所述癌癥包括但不限于非小細胞肺癌、小細胞肺癌、黑素瘤、腎細胞癌、尿路上皮癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、結腸直腸癌、胃癌、前列腺癌和肉瘤。“治療有效量”或“治療有效劑量”是指將使被治療的紊亂的一種或更多種癥狀緩解至一定程度的被施用的治療劑的量。治療有效劑量可以通過確定ic50(半最大抑制濃度)從細胞培養物測定初始地評估。然后，可以在動物模型中配制劑量以實現包括如在細胞培養物中確定的ic50的循環血漿濃度范圍。此類信息可以被用于更精確地確定在人類中有用的劑量。血漿中的水平可以例如通過hplc測量。確切的組合物、施用途徑和劑量可以由個體醫師鑒于受試者的狀況來選擇。可以調整劑量方案以提供最佳的期望的響應(例如，治療響應或預防響應)。例如，可以施用單次團注，可以隨時間施用若干分次劑量(多個或重復或維持)并且劑量可以根據治療情境的迫切需要所指示的按比例減少或增加。為了便于施用和劑量的一致性，配制呈劑量單位形式的腸胃外組合物是特別有益的。如本文使用的劑量單位形式是指適合作為用于待治療的哺乳動物受試者的單一劑量的物理分散的單位；每一個單位包含與需要的藥物運載體一起的被計算產生期望的治療作用的預定的量的活性化合物。本公開內容的劑量單位形式的規格將主要由抗體的獨特特征和待實現的特定治療作用或預防作用決定。因此，技術人員將理解，基于本文提供的公開內容，根據治療領域熟知的方法調整劑量和給藥方案。即，最大可耐受劑量可以被容易地確定，并且向受試者提供可檢測的治療益處的有效量也可以被確定，向受試者提供可檢測的治療益處而施用每種劑的時間要求同樣可以被確定。因此，盡管在本文中例舉了某些劑量和施用方案，這些實例絕非限制在實踐本公開內容時可以向受試者提供的劑量和施用方案。應注意，劑量值可以隨著待減輕的狀況的類型和嚴重性而變化，并且可以包括單個劑量或多于一個劑量。還應理解，對于任何特定受試者，應根據個體需要和施用組合物或監督組合物的施用的人士的專業判斷隨時間調整具體劑量方案，并且本文列出的劑量范圍僅是示例性的并且不意圖限制所要求保護的組合物的范圍或實踐。此外，本公開內容的組合物的劑量方案可以基于多個因素，包括疾病的類型、受試者的年齡、體重、性別、醫學狀況、狀況的嚴重程度和施用途徑。因此，劑量方案可以廣泛變化，但可以使用標準方法常規地確定。例如，劑量可以基于藥代動力學或藥效動力學參數調整，該參數可以包括臨床作用諸如毒性作用和/或實驗值。因此，本公開內容包括如由技術人員確定的受試者內的劑量遞增(intra-subject?dose-escalation)。確定適當的劑量和方案是相關中熟知的并且將被理解為一旦提供本文所公開的教導，則由技術人員掌握。對于本公開內容的vitokine或vitokine變體的治療有效量或預防有效量的示例性的、非限制性的每天給藥范圍可以為0.0001至100mg/kg體重、0.0001至90mg/kg體重、0.0001至80mg/kg體重、0.0001至70mg/kg體重、0.0001至60mg/kg體重、0.0001至50mg/kg體重、0.0001至40mg/kg體重、0.0001至30mg/kg體重、0.0001至20mg/kg體重、0.0001至10mg/kg體重、0.0001至5mg/kg體重、0.0001至4mg/kg體重、0.0001至3mg/kg體重、0.0001至2mg/kg體重、0.0001至1mg/kg體重、0.001至50mg/kg體重、0.001至40mg/kg體重、0.001至30mg/kg體重、0.001至20mg/kg體重、0.001至10mg/kg體重、0.001至5mg/kg體重、0.001至4mg/kg體重、0.001至3mg/kg體重、0.001至2mg/kg體重、0.001至1mg/kg體重、0.010至50mg/kg體重、0.010至40mg/kg體重、0.010至30mg/kg體重、0.010至20mg/kg體重、0.010至10mg/kg體重、0.010至5mg/kg體重、0.010至4mg/kg體重、0.010至3mg/kg體重、0.010至2mg/kg體重、0.010至1mg/kg體重、0.1至50mg/kg體重、0.1至40mg/kg體重、0.1至30mg/kg體重、0.1至20mg/kg體重、0.1至10mg/kg體重、0.1至5mg/kg體重、0.1至4mg/kg體重、0.1至3mg/kg體重、0.1至2mg/kg體重、0.1至1mg/kg體重、1至50mg/kg體重、1至40mg/kg體重、1至30mg/kg體重、1至20mg/kg體重、1至10mg/kg體重、1至5mg/kg體重、1至4mg/kg體重、1至3mg/kg體重、1至2mg/kg體重或1至1mg/kg體重。應注意到，劑量值可以隨著待被緩解的狀況的類型和嚴重性變化。還應理解，對于任何特定受試者，應根據個體需要和施用組合物或監督組合物的施用的人士的專業判斷隨時間調整具體劑量方案，并且本文列出的劑量范圍僅是示例性的并且不意圖限制所要求保護的組合物的范圍或實踐。本公開內容的藥物組合物的毒性和治療指數可以通過在細胞培養物或實驗動物中的標準藥學程序，例如用于確定ld50(對50％的群體致死的劑量)和ed50(對50％的群體治療有效的劑量)的標準藥學程序來確定。毒性劑量和治療有效劑量之間的劑量比是治療指數，并且治療指數可以表示為比率ld50/ed50。表現出大治療指數的組合物通常是優選的。vitokine構建體藥物組合物的施用的給藥頻率取決于療法的性質和被治療的特定疾病。受試者可以以規律間隔治療，諸如每周地或每月地，直到實現期望的治療結果。示例性給藥頻率包括但不限于：無間斷地每周一次；每隔一周地每周一次；每2周一次；每3周一次；無間斷地每周一次，持續2周，然后每月一次；無間斷地每周一次，持續3周，然后每月一次；每月一次；每兩個月一次；每3個月一次；每4個月一次；每5個月一次；或每6個月一次，或每年一次。組合療法本子部分“組合療法”的后續段落將利用pd1靶向性il-2?vitokine(vitokine)構建體作為說明性實例，然而這些概念應同樣適用于本發明的pd1靶向性il-2免疫細胞因子。如本文使用的，提及本公開內容的vitokine構建體和一種或更多種其他治療劑時，術語“共施用(co-administration)”、“共施用(co-administered)”和“與...組合(incombination?with)”意圖意指，并且的確是指并且包括以下：本公開內容的vitokine構建體和一種或更多種治療劑的此類組合同時施用至需要治療的受試者，其中這樣的組分被一起配制成單一劑型，所述單一劑型在基本上相同的時間將所述組分釋放至所述受試者；本公開內容的vitokine構建體和一種或更多種治療劑的此類組合基本上同時施用至需要治療的受試者，其中這樣的組分彼此分開配制成單獨的劑型，所述單獨的劑型在基本上相同的時間被所述受試者服用，屆時所述組分基本上在相同的時間釋放至所述受試者；本公開內容的vitokine構建體和一種或更多種治療劑的此類組合順序施用至需要治療的受試者，其中這樣的組分彼此分開配制成單獨的劑型，所述單獨的劑型被所述受試者在連續的時間服用，每次施用之間具有顯著的時間間隔，屆時所述組分在基本上不同的時間釋放至所述受試者；以及，本公開內容的vitokine構建體和一種或更多種治療劑的此類組合順序施用至需要治療的受試者，其中這樣的組分一起配制成單一劑型，所述單一劑型以受控方式釋放所述組分，屆時所述組分在相同和/或不同的時間同時、連續和/或重疊地釋放至所述受試者，其中每個部分可以通過相同或不同的途徑施用。在另一方面，本公開內容提供了一種用于治療受試者的癌癥或癌癥轉移的方法，該方法包括施用與第二療法組合的治療有效量的本發明的藥物組合物，所述第二療法包括但不限于免疫療法、細胞毒性化學療法、小分子激酶抑制劑靶向療法、手術、放射療法和干細胞移植。例如，這樣的方法可以被用于預防性癌癥預防、預防手術后癌癥復發和轉移，以及作為其他常規癌癥療法的輔助手段。本公開內容認識到，常規癌癥療法(例如，化學療法、放射療法、光療法、免疫療法和手術)的有效性可以通過本文描述的組合方法的使用來增強。大量的常規化合物已經被證明具有抗贅生活性。這些化合物已經被用作化學療法中的藥劑以縮小實體瘤、預防轉移和進一步生長、或減少白血病或骨髓惡性腫瘤中的惡性t細胞的數目。盡管化學療法在治療多種類型的惡性腫瘤中是有效的，但許多抗贅生化合物誘導不期望的副作用。已經顯示，當將兩種或更多種不同的治療組合時，治療可以協同地起作用，并且允許降低每種治療的劑量，從而降低每種化合物在較高的劑量產生的有害副作用。在其他情況下，對于治療是難治性的惡性腫瘤可以響應于兩種或更多種不同治療的組合療法。在各種實施方案中，第二抗癌劑，諸如化學治療劑將被施用至患者。示例性化學治療劑的列表包括但不限于，柔紅霉素、更生霉素(dactinomycin)、多柔比星、博萊霉素、絲裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法侖、環磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、苯達莫司汀、阿糖胞苷(ca)、5-氟尿嘧啶(5-fu)、氟尿苷(5-fudr)、氨甲蝶呤(mtx)、秋水仙堿、長春新堿、長春花堿、依托泊苷、替尼泊苷、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、噴司他丁、克拉屈濱、阿糖胞苷、吉西他濱、普拉曲沙、米托蒽醌、己烯雌酚(des)、氟達拉濱(fluradabine)、異環磷酰胺、紫杉烷(hydroxyureataxanes)(諸如紫杉醇和多西他賽(doxetaxel))和/或蒽環類抗生素，以及劑的組合，諸如但不限于da-epoch、chop、cvp或folfox。在各種實施方案中，這樣的化學療法劑的劑量包括但不限于約10mg/m2、20mg/m2、30mg/m2、40mg/m2、50mg/m2、60mg/m2、75mg/m2、80mg/m2、90mg/m2、100mg/m2、120mg/m2、150mg/m2、175mg/m2、200mg/m2、210mg/m2、220mg/m2、230mg/m2、240mg/m2、250mg/m2、260mg/m2和300mg/m2中的任一種。在各種實施方案中，本公開內容的組合治療方法還可以包括向受試者施用治療有效量的免疫療法，所述免疫療法包括但不限于，使用針對特定腫瘤抗原的消耗性抗體的治療；使用抗體-藥物綴合物的治療；使用針對共刺激性或共抑制性分子(免疫檢查點)的激動性抗體、拮抗性抗體或阻斷性抗體的治療，諸如包括但不限于針對ctla-4、pdl-1、cd40、ox-40、cd137、gitr、lag3、tim-3、sirpα、cd47、gitr、icos、cd27、siglec?7、siglec?8、siglec9、siglec?15、vista、cd276、cd272、tim-3和b7-h4的抗體；使用雙特異性t細胞結合抗體諸如博納吐單抗的治療；涉及施用生物響應調節劑(諸如il-7、il-10、il-12、il-15、il-21、il-22、gm-csf、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、tgf-β拮抗劑或tgf-β陷阱)的治療；使用治療性疫苗(包括但不限于溶瘤病毒，諸如t-vec)或使用治療性疫苗諸如sipuleucel-t的治療；使用樹突細胞疫苗或腫瘤抗原肽或新抗原疫苗的治療；使用嵌合抗原受體(car)-t細胞的治療；使用car-nk細胞的治療；使用nk細胞的治療；使用ips誘導的nk細胞的治療；使用ips誘導的t細胞的治療；使用ips誘導的car-t細胞或ips誘導的car-nk細胞的治療；使用腫瘤浸潤性淋巴細胞(til)的治療；使用過繼轉移的抗腫瘤t細胞(離體擴增的t細胞和/或tcr-t細胞)的治療；使用tall-104細胞的治療；和使用免疫刺激劑諸如toll樣受體(tlr)激動劑cpg、tlr7、tlr8、tlr9和疫苗諸如卡介苗(bcg)和咪喹莫特的治療；其中組合療法提供了增加的對腫瘤細胞的效應細胞殺傷，即，當被共施用時，vitokine構建體和免疫療法之間存在協同作用。在各種實施方案中，組合療法包括同時施用在同一藥物組合物中或在單獨的藥物組合物中的vitokine構建體和第二劑組合物。在各種實施方案中，順序施用vitokine構建體組合物和第二劑組合物，即，在施用第二劑組合物之前或之后施用vitokine構建體組合物。在各種實施方案中，vitokine構建體組合物和第二劑組合物的施用是同時的，即，vitokine構建體組合物和第二劑組合物的施用時間段彼此重疊。在各種實施方案中，vitokine構建體組合物和第二劑組合物的施用是非同時的。例如，在各種實施方案中，終止vitokine構建體組合物的施用，然后施用第二劑組合物。在各種實施方案中，在施用vitokine構建體組合物之前終止第二劑組合物的施用。提供以下實施例以更充分地說明本公開內容，但不應解釋為限制本公開內容的范圍。實施例1帕博利珠單抗可變結構域的序列優化本發明旨在優化帕博利珠單抗的可變結構域序列以增強與人類種系序列的相似性評分(一種用于“人源性”的量度)。這種增強可以潛在地降低免疫原性風險。另外，本發明人使用人類vh3家族種系序列作為可選的受體框架，其盡管與帕博利珠單抗同源性較低，但更普遍且表現更好。這樣做的目的是改善所得人源化抗體的生物物理特性，確保其保留全部活性，并增強它的序列人源性。使用rcsb蛋白數據庫中可獲得的最同源的人類抗體序列作為受體人類框架，通過cdr接枝技術將帕博利珠單抗人源化。在genbank中發現的登錄號ab063829(seq?id?no:40)和m29469(seq?id?no:41)的框架分別用作重鏈可變結構域(vh)和輕鏈可變結構域(vl)的受體人類框架(carven?gj等人，us8354509b2)。然而，根據使用國際免疫遺傳學信息系統(imgt)domaingapalign工具(www.imgt.org)對可變區外顯子的比較，帕博利珠單抗與其最接近的人類種系ighv1-2僅共有79.6％序列同一性。在2014年，who的國際非專利名稱(inn)小組提出了與人類種系序列的相似性評分作為用于治療性抗體的定義標準，假定基于較高的相似性可能表明免疫原性降低的觀點。帕博利珠單抗重鏈的低相似性評分或“人源性程度”(abhinandan?kr等人，j?mol?biol(2007)369:852-62)可能是由于小鼠cdr與其人類序列等同物之間的保守水平較差，需要保留一些結構上重要的小鼠框架殘基以再現抗原結合，并且在人類框架序列ab063829中保持獨特的體細胞突變。為了增強帕博利珠單抗的人源性程度，靶向某些cdr殘基以用從最接近的人類種系序列的其等同物殘基取代。該方法在本文中被稱為cdr種系化(cdr?germlining)。雖然避免cdr擾動傳統上是人源化ab設計的中心原則，但只有有限數量的cdr殘基參與直接抗原相互作用。因此，可以替換某些cdr殘基而不損害抗體活性。根據kabat編號方案，cdr被定義為氨基酸殘基24-34(cdr-l1)、50-56(cdr-l2)、89-97(cdr-l3)、31-35b(cdr-h1)、50-65(cdr-h2)和95-102(cdr-h3)。對于cdr3序列，輕鏈cdr3(cdr-l3)的一部分和整個重鏈cdr3(cdr-h3)不是種系序列的可變區外顯子v區的一部分。因此，不存在可用于替代小鼠cdr對應物的人類種系殘基。另外，cdr3，尤其是cdr-h3是高度可變的并且對于抗原結合和功能活性至關重要，使得保持cdr3的構象至關重要。因此，cdr種系化過程不包括帕博利珠單抗的cdr-l3(qhsrdlplt；seqid?no:25)和cdr-h3(rdyrfdmgfdy；seq?id?no:33)。將帕博利珠單抗的cdr-l1和cdr-l2的序列與來自最接近的人類種系igkv3d-11(genbank登錄號x17264；seq?id?no:39)的對應物進行比對。比對在表6a中示出。同樣，帕博利珠單抗的cdr-h1和cdr-h2序列與最接近的人類種系序列ighv1-2(genbank登錄號x62106；seq?id?no:37)的比對展示在表6b中。表6a帕博利珠單抗的cdr-l1序列和cdr-l2序列與igkv3d-11的比對表6b帕博利珠單抗的cdr-h1序列和cdr-h2序列與ighv1-2的比對“-”表示序列空位。粗體且斜體的殘基代表根據復合物結構與pd1相互作用的殘基(horita?s.等人，sci?rep(2016)6:35297)。加下劃線的殘基經受cdr種系化過程。多個帕博利珠單抗cdr殘基直接參與與pd1的極性相互作用，例如，氫鍵和鹽橋(horita，s.等人sci.rep(2016).6:35297)。vl和vh?cdr1和cdr2中或周圍的接觸殘基包括cdr-l1中的lser28、ltyr30，緊接cdr-l2之前的ltyr49，cdr-l2中的ltyr53，cdr-h1中的htyr33、htyr35，cdr-h2中的hasn52、hser53、hasn54、hthr57、hasn58(其中上標字母“l”表示輕鏈，并且“h”表示重鏈)。除了ltyr49，其不是cdr殘基并且未示出，所有上述抗原相互作用cdr殘基在表6a和表6b中為粗體且斜體。在與種系序列不同的cdr殘基中，cdr-l1殘基llys27、lhis34，cdr-l2殘基lleu54、lglu55，cdr-h2殘基hphe59、hasn60、hglu61、hlys64和hasn65(在表6a和表6b中加下劃線)被選擇用于cdr種系化。它們被用其各自的人類種系等同物用以下氨基酸取代替換：lk27q、lh34a、ll54r、le55a、hf59y、hn60a、he61q、hk64q和hn65g，單獨或組合。保留其他cdr殘基以避免抗原相互作用殘基的任何破壞。對于cdr-h1(nyymy；seq?id?no:26)，只有單個殘基hasn31符合cdr種系化，被人類種系序列中的等效殘基甘氨酸替代。其他殘基被保留，因為它們參與與pd1的直接抗原相互作用(htyr33和htyr35)或因為它們在小鼠和人類種系序列之間是保守的(htyr32和hmet34)。然而，考慮到cdr-h1只有5個氨基酸的較短長度以及兩個殘基與抗原直接相互作用的事實，任何氨基酸改變都可能潛在地干擾cdr確認并影響抗體的活性。因此，hasn31未通過cdr種系化修飾，并且cdr-h1完全保留。除了小鼠cdr與其對應的人類種系序列之間的低水平保守性之外，帕博利珠單抗重鏈框架(fr)還含有多個非種系殘基。它們的產生是由于受體框架序列ab063829中獨特的體細胞突變的保留。這些體細胞突變，包括fr-h1中的hval9，fr-h3中的hthr76、hlys82a、hgln83、hphe84和fr-h4中的hthr108，被認為在結構上不重要。用它們各自的種系對應物hv9a、ht76s、hk82as、hq83r、hf84s、ht108l替換，導致與人類種系序列的相似性評分的顯著提高，而不干擾cdr構象或改變抗體的活性。此外，ighv3-23(seq?id?no:38)用作可選受體框架，以研究利用具有顯著較低序列同源性但生物物理屬性優越的人類受體框架是否可以增強所得人源化抗體的生物物理特性而不損害其功能活性。ighv3-23屬于人類抗體重鏈種系vh3家族，其是人類貯庫中最常見的vh家族。它也是市售的人類單克隆抗體中最普遍的，并因其優越的藥物樣特性而被廣泛認可。鑒于cdr構象對周圍框架的化學環境異常敏感，選擇帕博利珠單抗中不同于vh3種系家族等同物的一些結構上重要的框架殘基，用于回復突變至它們對應的帕博利珠單抗等同物。此外，幾個cdr-h2殘基被靶向，以使用ighv3-23?cdr-h2作為模板進行cdr種系化，以提高與人類種系序列的相似性評分。帕博利珠單抗的cdr-h1序列和cdr-h2序列與ighv3-23的比對展示在表6c中。六個cdr-h2殘基hphe59、hasn60、hglu61、hlys62、hphe63和hasn65(在表6c中加下劃線；上標字母“l”表示輕鏈，并且“h”表示重鏈)被選擇用以下氨基酸取代進行cdr種系化：hf59y、hn60a、he61d、hk62s、hf63v和hn65g。由于前面描述的原因，cdr種系化過程不包括cdr-h1。表6c帕博利珠單抗的cdr-h1序列和cdr-h2序列與ighv3-23的比對粗體且斜體的殘基代表根據復合物結構與pd1相互作用的殘基(horita?s.等人，sci?rep(2016)6:35297)。加下劃線的殘基行cdr種系化過程。加下劃線的殘基進行cdr種系化過程。兩個框架殘基，hthr30和harg94，被認為是結構上重要的，并且被保留而不改變為其對應的種系等同物hser30和hlys94。五個另外的ighv3框架殘基hval48、hser49、hile69、harg71和hasn73屬于vernier區(美國專利第5,821,337號和美國專利第5,859,205號)并且可能是結構上重要的，被單獨地或組合地回復為其對應的帕博利珠單抗殘基hmet48、hgly49、hleu69、hthr71和hser73。通過實驗評估特定框架氨基酸殘基的重要性。使回復突變的數量最小化，以確保與種系序列的最高相似性評分，而不會對抗體活性產生負面影響。將所有優化的抗體序列表達為全長抗體，所述全長抗體具有含有seq?id?no:34中列出序列的κ輕鏈恒定區和含有seq?id?no:35中列出序列的修飾的igg1重鏈恒定區。表7列出了示例性優化的pd1阻斷抗體的vl、vh、cdr-l1、cdr-l2和cdr-h2的seq?id?no以及包含seq?id?no:2和seq?id?no:6中分別列出的vl序列和vh序列的參考抗體(p-0734)。本發明的所有抗體包含相同的cdr-l3(seq?id?no:25)、cdr-h1(seq?id?no:26)和cdr-h3(seq?idno:33)。表7由cdr和fr種系化產生的示例性pd1阻斷抗體實施例2優化的pd1阻斷抗體的構建、產生和純化對所有基因進行密碼子優化以便在哺乳動物細胞中表達，并且它們通過genscript的服務被合成并隨后亞克隆到接受者哺乳動物表達載體中。蛋白表達由cmv啟動子驅動，并且合成的sv40?polya信號序列位于編碼序列的3’末端處。在構建體的n末端處工程化前導序列，以確保合適的信號傳導和加工以便分泌。通過按照制造商的說明在expicho細胞(thermofisher)中以1:1的比例共轉染含有輕鏈和重鏈的載體來產生抗體。在轉染當天，將expicho細胞在expichotm表達培養基(thermofisher)中稀釋至6x?106個細胞/ml。將總計0.8μg?dna/ml培養基體積的表達載體與冷optiprotm培養基(40μl/ml細胞培養基)混合。在加入3.2μl/ml細胞培養基的expifectaminetm?cho試劑后，輕輕混合溶液，并隨后在室溫孵育5分鐘。然后將expifectaminetm?cho/質粒dna復合物緩慢轉移至細胞，并在37℃在具有8％的co2氣氛的震蕩培養箱中以130rpm孵育。轉染后18-22小時，將expifectaminetm?cho增強劑(6μl/ml細胞培養基)和expichotm補料(240μl/ml細胞培養基)加入到溫和旋轉的瓶中。培養8天后，收獲上清液，以2200rpm離心20min進行純化，然后使用0.22μm過濾器(corning)進行無菌過濾。使用蛋白a親和色譜從細胞培養物上清液純化所分泌的抗體。將細胞培養物上清液加載到用5倍柱體積(cv)的磷酸鹽緩沖鹽水ph?7.2(thermofisher)平衡過的mabselectsure?5ml柱(cytiva)上。通過用5cv的pbs?ph?7.2洗滌來去除未結合的蛋白，并用25mm檸檬酸鈉、25mm氯化鈉緩沖液ph?3.2洗脫目標蛋白。通過添加3％的1m?tris緩沖液(ph?10.2)來中和抗體溶液，隨后使用具有10kda?mwco的ultra-15?ultracel(merckmillipore)濃縮并將緩沖液交換為pbs(ph?7.2)。通過具有和不具有還原劑的sds-page分析純化抗體的純度和分子量，并且然后用考馬斯亮藍(coomassie)(imperialtm蛋白質染色劑,thermofisher)染色。根據制造商的說明使用surepagetm預制凝膠系統(8-16％?bis-tris,genscript)。抗體的聚集體含量在agilent?1200高效液相色譜(hplc)系統上進行分析。將樣品注射到advancebio尺寸排阻柱(4.6x?150mm,2.7μm,lc柱,agilent)中，在25℃使用150mm磷酸鈉緩沖液ph?7.0作為流動相。純化的蛋白樣品的抗體濃度通過使用nanodrop分光光度計(thermofisher)測量280nm處的吸光度除以基于它的氨基酸序列計算的摩爾消光系數來確定。根據制造商的說明，使用endosafe?nexgen-pts(charles?river)測量純化的蛋白樣品的內毒素水平。實施例3評價優化的pd1阻斷抗體的生物活性的測定通過熟知的方法諸如酶聯免疫吸附測定(elisa)測試本發明抗體的抗原結合活性。簡言之，在4℃將nunc?maxisorp板(thermofisher)用碳酸氫鹽緩沖液ph?9.4中的重組人類pd1蛋白(thermofisher)包被過夜，每孔使用1μg抗原(100μl/孔)。用pbs/0.05％吐溫20洗滌三次后，將板與superblock(thermofisher)在室溫孵育兩小時以阻斷非特異性結合。將用封閉緩沖液(含1％牛血清白蛋白的pbs)系列三倍稀釋的pd1抗體添加至清洗后的板(100μl/孔)，并在室溫孵育一小時。在另一次洗滌后，通過與在封閉緩沖液中以1:5000稀釋的辣根過氧化物酶(hrp)綴合的山羊抗人類igg?fc抗體(thermofisher)(100μl/孔)在室溫孵育1小時來檢測抗體。最終洗滌后，加入100μl/孔的tmb底物(thermofisher)。將板密封并在黑暗中進行孵育5-20分鐘。通過加入2n硫酸(ricca?chemical)(50ul/孔)停止反應，并用板讀取器測量450nm處的吸光度。繪制曲線，并使用graphpad?prism軟件計算半最大有效濃度(ec50)值。另外，使用穩定表達人類pd1基因的hek?293t細胞(crown?bioscience)通過流式細胞術測定優化的pd1抗體的基于細胞的結合強度。收獲后，將hek293-hpd1細胞以1x?105個細胞/孔(100μl)接種到96孔u底板中，與fc?block(1:50)在4℃孵育20分鐘，并隨后用facs緩沖液(pbs，1％?fbs)洗滌。然后在4℃用facs緩沖液中濃度范圍為0.01-100nm的每種抗體的三倍系列稀釋液處理細胞30分鐘。隨后，用facs緩沖液洗滌細胞兩次以除去未結合的分子，并向細胞添加40μl?1:100稀釋的pe標記的山羊抗人類fc二抗(ebiosciences)。在4℃孵育30分鐘并用facs緩沖液再洗滌兩次后，通過流式細胞術(bd?accuri-c6)用pe標記的二抗檢測與細胞結合的抗體，并且使用graphpad?prism軟件計算ec50值。此外，使用解凍即用(thaw-and-use)形式的promega螢光素酶報告物測定(一種基于生物學相關機制的測定)來測量阻斷pd1相互作用的效力。完全按照制造商的方案中所描述的進行細胞解凍和鋪板程序。簡言之，將一小瓶(0.5ml)pd-l1?aapc/cho-k1細胞解凍并與14.5ml細胞恢復培養基(90％?ham’s?f12/10％?fbs)混合。接下來，將100μl該細胞懸浮液添加至兩個96孔平底測定板的內部的60個孔，而外周孔接收100μl細胞恢復培養基。在37℃和5％?co2孵育過夜后，棄去培養基。內部孔接收40μl?3倍系列稀釋的化合物，而外周孔收到80μl測定緩沖液(99％rpmi?1640/1％?fbs)。隨后，將一小瓶(0.5ml)pd1效應細胞解凍并與5.9ml測定緩沖液混合，并將40μl該混合物添加至內部孔。在37℃、5％?co2孵育6小時并在室溫平衡7分鐘后，向所有孔加入80μl?bio-glotm試劑。然后將板在室溫振蕩孵育10分鐘。使用發光板讀取器(biotek?synergy?h1)測量所產生的發光。通過平均外周孔的相對光單位(rlu)來計算背景。將誘導倍數確定為抗體樣品的rlu減去背景，除以對照樣品(無抗體)的rlu減去背景，或誘導倍數＝rlu(抗體-背景))/(rlu(無抗體對照-背景))。最后，使用用graphpad?prism軟件擬合的曲線確定ec50值。實施例4評價包含基于最接近的人類種系序列的種系化修飾的pd1抗體首先，將p-0734抑制pd1/pd-l1相互作用的有效性與帕博利珠單抗(pbl)生物類似物進行比較。雖然p-0734和pbl生物類似物共有相同的可變結構域，但它們的重鏈恒定區不同。pbl包含含有s228p突變的igg4恒定鏈(seq?id?no:36)，而p-0734具有含有l234a/l235a/g237a突變的igg1恒定鏈(seq?id?no:35)以消除fc效應子功能。如圖4中示出的，p-0734和pbl生物類似物在阻斷pd1和pd-l1之間的相互作用方面同等有效。該結果是預期的，并證實阻斷pd1的能力由可變結構域序列決定，而不是由免疫球蛋白類別決定。p-0734忠實地重現了pbl生物類似物阻斷pd1/pd-l1相互作用的效力，并在本文稱為參考抗體。使用突變背景略有不同的抗體評估了cdr種系化取代cdr-l1中的lh34a和cdr-h2中的hf60y的影響。p-1148、p-1150、p-1151和p-1153這些抗體均含有種系化取代：cdr-l1中的lk27q，cdr-l2中的ll54r、le55a，以及cdr-h2中的hn60a、he61q、hk64q、hn65g。p-1150包含另外的cdr-l1中的lh34a取代，p-1151具有額外的cdr-h2中的hf59y取代，并且p-1153還另外含有lh34a和hf59y兩個變化。表8提供了這些示例性pd1阻斷抗體的cdr種系化取代的列表。表8示例性pd1阻斷抗體的cdr種系化取代 pd1?ab cdr-l1 cdr-l2 chr-h2 p-1148 <![cdata[<sup>l</sup>k27q]]> <![cdata[<sup>l</sup>l54r,<sup>l</sup>e55a]]> <![cdata[<sup>h</sup>n60a,<sup>h</sup>e61q,<sup>h</sup>k64q,<sup>h</sup>n65g]]> p-1150 <![cdata[<sup>l</sup>k27q,<sup>l</sup>h34a]]> <![cdata[<sup>l</sup>l54r,<sup>l</sup>e55a]]> <![cdata[<sup>h</sup>n60a,<sup>h</sup>e61q,<sup>h</sup>k64q,<sup>h</sup>n65g]]> p-1151 <![cdata[<sup>l</sup>k27q]]> <![cdata[<sup>l</sup>l54r,<sup>l</sup>e55a]]> <![cdata[<sup>h</sup>f59y,<sup>h</sup>n60a,<sup>h</sup>e61q,<sup>h</sup>k64q,<sup>h</sup>n65g]]> p-1153 <![cdata[<sup>l</sup>k27q,<sup>l</sup>h34a]]> <![cdata[<sup>l</sup>l54r,<sup>l</sup>e55a]]> <![cdata[<sup>h</sup>f59y,<sup>h</sup>n60a,<sup>h</sup>e61q,<sup>h</sup>k64q,<sup>h</sup>n65g]]> 如圖5b和圖5c所圖示以及表9中總結的，cdr-l1種系化取代lh34a一致地導致pd1阻斷效力(ec50)降低約3.5倍，同時emax(最大效應/發光信號)和誘導倍數兩者均降低25％，無論hf59y取代存在(p-1151與p-1153)還是不存在(p-1148與p-1150)。類似地評估了hf59y種系化取代的影響，數據示出于圖5b和圖5c中，并總結在表9中。無論lh34a取代存在(p-1150與p-1153)還是不存在(p-1148與p-1151)，hf59y?cdr種系化取代都導致效力(ec50；降低約1.8倍)和信號(emax和誘導倍數兩者均降低10％-15％)兩者一致但適中的降低。與p-0734相比，p-1153中累積的cdr種系化取代最終導致pd1阻斷效力(ec50)降低近20倍，并且emax降低50％。因此，lh34a和hf59y取代兩者在該特定框架中被認為是有害的，而原始cdr殘基lhis34和hphe59將被保留。然而，盡管在阻斷pd1/pd-l1相互作用的效力方面存在顯著差異，但所有四種優化的pd1抗體和參考抗體p-0734展示出幾乎相同的結合強度，ec50值接近100pm(圖5a和表9)。表9示例性pd1阻斷抗體的elisa結合和pd1阻斷活性這部分數據表明，基于機制的功能測定能夠辨別elisa結合測定無法檢測到的微小活性變化。因此，熒光素酶pd1/pd-l1報告物測定在本文中用作表征和排序源自帕博利珠單抗的經由種系化取代的pd1阻斷抗體的主要工具。預期保持完全功能活性的衍生抗體將表現出與帕博利珠單抗相同的體內功效。cdr-l2種系化取代le55a的潛在負面影響通過比較p-1127和p-1129進一步評估。這兩種分子都含有輕鏈cdr中的lk27q和lk54e種系取代，唯一的序列差異是額外的在p-1129中的cdr-l2取代le55a。如圖6a中顯示，p-1129展示出輕微但可察覺的效力降低(p-1127和p-1129的ec50分別＝0.39nm和0.58nm)，并且emax少量下降10％。因此，le55a氨基酸取代被認為是不利的，并且原始殘基lglu55將被保存。p-1174，含有總共6個cdr種系化取代：lk27q、ll54r、hn60a、he61q、hk64q和hn65g，表現出與p-1127和p-0734相同的pd1阻斷活性，p-0734、p-1127和p-1174的ec50分別為0.64nm、0.54nm和0.67nm(圖6b)。另外，p-1148通過消除一個cdr種系化取代le55a而衍生為p-1174。當與p-0734相比時，p-1174表現出比p-1148更高的效力(參見圖5b和圖6b)。這部分數據還合作得出了原始cdr殘基lglu55不應被改變的結論。除了小鼠cdr與其人類種系對應物之間的低保守性之外，帕博利珠單抗vh框架中的多個非種系殘基也導致與種系的低序列相似性評分。這些非種系殘基，來源于受體框架序列中保留的獨特體細胞突變，包括fr-1中的hval9，fr-3中的hthr76、hlys82a、hgln83、hphe84，和fr-4中的hthr108，被認為在結構上不重要。為了進一步增強與種系的序列相似性評分或人源性程度，p-1174框架中的這些非種系殘基被替換為它們各自的種系等同物hv9a、ht76s、hk82as、hq83r、hf84s、ht108l，得到p-1271。如預期的，p-1271展示出與參考抗體p-0734相同的pd1阻斷活性(圖6c)，p-1271和p-0734的ec50值分別為0.66nm和0.70nm。綜上所述，p-1174和p-1271中的cdr種系化取代lk27q、ll54r、hn60a、he61q、hk64q和hn65g增強了抗體序列的人源性程度，而不損害阻斷pd1/pd-l1相互作用的效力。p-1271中另外的六個框架種系化取代還增加了與最接近的人類種系序列的相似性評分。表10列出了與參考抗體p-0734相比p-1174和p-1271的種系化取代和與最接近的人類種系序列的相似性評分。表10示例性優化的pd1抗體p-1174和p-1271的種系化取代和與最接近的人類種系序列的相似性評分實施例5評價包含基于更普遍的人類種系家族(vh3)的種系化修飾的pd1抗體研究了基于人類抗體重鏈種系ighv3-23(seq?id?no:38)的框架種系化取代的采用，以檢查具有顯著較低序列同源性但具有優越生物物理特性的抗體框架是否可以增強所得抗體的藥物樣特性，而完全保留其功能活性。在33個框架種系化取代中(表11a)，5個vernier區殘基hv48、hs49、hi69、hr71和hn73的重要性通過單獨或組合地回復突變至其各自的帕博利珠單抗等同物hv48m、hs49g、hi69l、hr71t和hn73s來進行實驗評估。此外，選擇了六個cdr-h2殘基hf59y、hn60a、he61d、hk62s、hf63v和hn65g，用其在ighv3-23中的對應殘基進行cdr種系化取代。表11b提供了示例性抗體中vh3種系化取代的總結。表11a基于ighv3-23的vh框架種系化取代粗體且加下劃線的殘基代表總共33個框架種系化取代。表11b基于ighv3-23的vh?cdr種系化和fr回復突變圖7描繪了p-1175和p-1181的pd1阻斷活性，p-1175和p-1181僅在它們的cdr-h2種系化取代中不同(如表11b中所示)。與p-0734相比，p-1175和p-1181兩者在阻斷pd1相互作用方面表現出顯著減弱的效力。具體地，p-1175顯示出效力(ec50)10倍降低，以及emax和誘導倍數兩者均下降25％。這與p-1181的效力下降15倍，且emax和誘導倍數下降40％-50％形成對比(如圖7a和圖7b中所圖示，并總結在表12中)。由于p-1181展示出更急劇的活性下降，它的兩個不同的cdr種系化取代hk62s、hf63v被認為是有害的，因此原始cdr殘基，hlys62和hphe63將被保留。這些發現表明，單個cdr殘基的重要性需要實驗評估；甚至接近邊界或不緊鄰抗原接觸殘基的cdr殘基也可能對活性產生負面影響。將2至5個框架殘基回復突變引入p-1175，產生p-1176、p-1177和p-1178，如表11中詳述的。如圖8中的數據所示，p-1176中的組合的回復突變hi69l、hr71t和hn73s有效地恢復了pd1阻斷活性，幾乎與p-0734的水平相當。類似地，由于hv48m和hs49g的組合的回復突變，p-1177的活性顯著恢復，盡管不如p-1176有效。然而，這兩個回復突變(hv48m和hs49g)摻入p-1176中沒有導致所得抗體p-1178活性的進一步增強(圖8和表12中的p-1178與p-1176相比)。表12示例性pd1阻斷抗體的pd1阻斷活性通過比較p-1198(hn73s)、p-1199(hr71t、hn73s)和p-1201(hi69l、hr71t、hn73s)的pd1阻斷活性，進一步評估了hi69l、hr71t和hn73s這三個fr回復突變各自的重要性。如圖9中所顯示，每個添加的回復突變導致pd1阻斷活性的輕微但明顯的累積增加。只有p-1201中所有三個回復突變的組合導致幾乎完全恢復的功能活性(p-1201和p-0734的ec50值分別為1.28nm和0.78nm)。因此，所有三個回復突變hi69l、hr71t、hn73s被認為是必需的，并且將被摻入。此外，比較了p-1194、p-1201和p-1238的pd1抑制活性，并在圖10a和圖10b中圖示。p-1194和p-1201，區別僅在于一個額外的cdr種系化取代hf59y，展示出相同的pd1阻斷效力。這表明這個特殊的取代沒有對活性產生負面影響，這與先前當采用ighv1-2種系序列時hf59y種系化取代有害的觀察結果相矛盾。因此，假定單個cdr種系化取代的影響取決于周圍框架序列的背景。p-1238與參考抗體p-0734效力相同，ec50值分別為0.73nm和0.70nm。與p-1194相比，兩個額外的框架回復突變，p-1238中的hv48m和hs49g導致活性的輕微但可辨別的改善。在最終評估中，評估了p-1174、p-1193、p-1198、p-1199和p-1201與pd1+細胞的結合強度(圖11)。如預期的，完全保留pd1阻斷效力的p-1174(圖6c和圖6d)展示出與參考抗體p-0734相同的對pd1表達細胞的結合親和力(圖11a和圖11b)。含有1-3個框架回復突變的p-1198、p-1199和p-1201在阻斷pd1相互作用方面展示出細微但明顯的效力差異(圖9)，但在基于細胞的結合測定中未檢測到這樣的活性變化。所有三種化合物均顯示出與p-0734相同的與pd1+細胞結合的能力(圖11c和圖11d以及表13)。然而，基于細胞的結合測定能夠將不含框架回復突變的p-1193與其他化合物區分開，如圖11c和圖11d以及表13中所示。然而，降低的程度不如在阻斷測定中觀察到的明顯。數據還證實了我們先前的觀察：基于機制的pd1/pd-l1阻斷測定在鑒定細微活性差異方面比結合測定更敏感。表13示例性優化的pd1阻斷抗體與pd1+細胞的結合強度綜上所述，建立在vh框架(ighv3-23)上的優化的pd1阻斷抗體p-1194、p-1201和p-1238，具有顯著較低的序列同源性但具有優越的生物物理特性，能夠完全或幾乎完全保留抗體的功能活性，并展示出提高的與最接近的人類種系序列(ighv3-23)的相似性評分。在表14中總結了對于每種抗體的突變細節和相似性評分。表14示例性優化的pd1抗體的cdr種系化取代、fr回復突變和與最接近的人類種系序列的相似性評分實施例6種系化取代導致優化的pd1阻斷抗體的疏水性降低在23種fda和ema批準的治療性mab中，帕博利珠單抗是最疏水的一種，并因此具有最高的聚集傾向(goyon等人，j.chromatogr.b?1065-1066:35-43,2017)。與實驗確定的表觀疏水相互作用色譜(hic)保留因子(k)一致，ssh2.0疏水性預測工具(http://i.uestc.edu.cn/ssh2/；zhou等人，front.genet.13:842127,2022)指示，帕博利珠單抗的兩個可變鏈兩者都攜帶顯著的疏水相互作用風險。其vh和vl的疏水相互作用的概率分別為0.97和0.61。如果概率為0.5或更大(1是最大可能值)，則預測抗體具有高的疏水相互作用的風險。雖然種系化取代的聚焦是增強抗體序列的“人源性”的程度，但該過程也導致多種優化的抗體序列的疏水相互作用的概率顯著降低。表15提供了如通過ssh2.0估計的示例性優化的pd1阻斷抗體的可變結構域的疏水相互作用的預測概率的總結。表15具有提高的相似性評分和降低的疏水性相互作用概率同時保留pd1阻斷活性的示例性抗體的總結如表15中所示，兩個輕鏈cdr種系化取代lk27q和ll54r顯著降低了vl的疏水性概率，從p-0734的0.607降至0.131。將這兩個氨基酸變化應用于表15中列出的所有優化的pd1阻斷抗體中的vl。重鏈中的cdr種系取代僅導致疏水性少量的降低，疏水性概率從(p-0734)的0.971改變至(p-1174)的0.848，并且具有基于vh-3家族框架的vh的抗體改變至約0.8。然而，當在p-1174的vh框架中實施種系化取代(hv9a、ht76s、hk82as、hq83r、hf84s、ht108l)時，所得構建體p-1271具有0.185的疏水性概率，遠低于p-1174的疏水性概率。抗體表面上的疏水性斑塊(patch)通常涉及其聚集傾向的主要貢獻之一。此外，這些疏水性斑塊可導致高粘度。因此，預期具有顯著減少的疏水勢的示例性pd1阻斷抗體表現出改善的生物物理特性。預計使用這些優化的pd1阻斷抗體構建的pd1靶向性il-2免疫細胞因子和vitokine融合體也具有增強的可開發性譜。實施例7鑒定作為il-2?vitokine的遮蔽部分結構域的最佳il-2rαsushi變體代表性pd1?ab?il-2?vitokine構建體圖示于圖3中。作為活性部分結構域(d2)的單體il-2或il-2變體融合在pd1抗體(d1)和作為遮蔽部分結構域(d3)的il-2rαsushi結構域之間。連接il-2和il-2rα的接頭2(l2)是蛋白酶可裂解的。vitokine構建體內的il-2將保持惰性，直到其被腫瘤部位處或腫瘤微環境(tme)內獨特存在或上調的蛋白酶局部活化。在裂解l2接頭后，遮蔽性α-亞基理想地解離離開，如圖2中所圖示。因此，期望鑒定與il-2結合減弱的il-2rα變體，以確保遮蔽性α-亞基(d3)在蛋白水解后可以容易地擴散離開，但在接頭被裂解之前仍然有效地遮蔽il-2部分結構域的活性。il-2rαsushi變體被設計為通過在與il-2相互作用的殘基處摻入突變來減弱與il-2的結合。如表16中所列出的，示例性il-2rαsushi變體p-0751、p-0752和p-0753分別含有y43a、l42g和r36a突變。它們通過融合到knob-into-hole異源二聚體fc鏈對(seq?id?no:187和188)的knob?fc鏈表達為單體fc融合蛋白。p-0757是單體野生型il-2rαsushi的fc融合體。使用elisa評價這三種il-2rαsushi變體與il-2的結合能力。簡而言之，將il-2rαsushi變體fc融合蛋白以1μg/孔包被到nunc?maxisorp?96孔微孔板的孔上。在4℃孵育過夜并用1％?bsa封閉后，將p-0689(一種單體野生型il-2等同物(含有活性中性的c125i突變；seq?id?no:117)fc融合體)的系列稀釋液以100μl/孔加入到每個孔中。室溫孵育一小時后，加入100μl/孔的生物素抗il-2抗體克隆b33-2(bdbiosciences)，并室溫孵育1小時。隨后，以1:5000的稀釋度添加100μl/孔的親和素-hrp(biolegend)。孵育60分鐘并洗滌后加入100μl/孔的tmb底物(thermofisher)。將板密封并在室溫在黑暗中孵育。通過加入2n硫酸(ricca?chemical)停止反應。確定450nm處的吸光度，并使用graphpad?prism軟件擬合曲線。如表16中總結和圖12中所圖示，氨基酸取代y43a、l42g和r36a各自影響與il-2的相互作用。y43a變化導致il-2結合適中降低(8.1倍)，r36a取代導致結合ec50顯著的346倍降低，而l42g改變導致其與il-2的結合中等或35倍減少。表16il-2rα氨基酸變化對與il-2結合的影響將上述三種il-2rαsushi變體連同它們的野生型對應物用作遮蔽部分結構域以構建四種fc?il-2?vitokine分子。這些分子中的每一種包含作為活性部分結構域(d2)的單體il-2c125i變體(等同于野生型；seq?id?no:117)和連接il-2與il-2rαsushi(d3)的15個氨基酸的mmp2/9可裂解的l2接頭(seq?id?no:84)。異源二聚體fc鏈(seq?id?no:187和188)用作d1結構域。隨后通過經由人類pbmc測定評價它們在cd8+t細胞和nk細胞中誘導ki67(一種細胞增殖的標志物)表達的效力來評估這些變體的遮蔽效率。p-0704是一種il-2?p65r變體(seq?id?no:118)fc融合體，其保持其對二聚體il-2rβγ受體的野生型il-2效力，被包括作為該組fc?il-2?vitokine的完全活性il-2對照。簡而言之，通過ficoll-hypaque離心法從購自blood?oklahoma?institute的血沉棕黃層分離人類pbmc。將純化的人類pbmc用測試化合物的系列稀釋液處理，并在37℃孵育5天。在第五天，將細胞用facs緩沖液(1％?fbs/pbs)洗滌一次，并首先用fc阻斷劑(biolegend)和表面標志物抗體(包括1:50稀釋的抗人類cd56-fitc和抗人類cd8-apc(biolegend))染色。在30分鐘的孵育和洗滌后，用200μl/孔的1x固定及透化工作溶液(invitrogen)將細胞沉淀充分重懸，并在室溫在黑暗中孵育30分鐘。離心后，向每個孔添加200μl的1x透化緩沖液(invitrogen)進行另一次洗滌。將細胞沉淀以1:25稀釋重懸于含有抗人類ki67-pe(bd?life?sciences)的透化緩沖液中。在另外的室溫孵育30分鐘后，收集細胞，洗滌，并重懸于facs緩沖液中，并通過流式細胞術進行分析。數據表示為門控的群體內ki67陽性細胞的百分比。劑量-響應ki67增殖細節圖示于圖13a和圖13b中。另外，cd8+t細胞特異性數據總結于表17中。表17各種il-2?vitokine構建體的活性比較圖13圖示出了與p-0704(p-0701的完全活性的il-2fc融合體對應物)相比，p-0701具有野生型il-2rαsushi作為遮蔽部分結構域(d3)的在誘導cd8+t細胞和nk細胞增殖方面示出顯著的3-log降低。我們假設將il-2結合破壞突變整合到d3結構域中可能會削弱d3的遮蔽能力，從而減少vitokine的活性惰性。還預計這種降低的程度將與il-2和il-2rαsushi變體之間結合強度的減少水平一致。在圖13a和表17中，與p-0701相比，在作為d3結構域的il-2rαsushi中含有y43a和r36a的fc?vitokine?p-0754和p-0756展示出減弱的遮蔽能力。這導致在刺激cd8+t細胞增殖方面更高的vitokine固有基礎，并且該趨勢在nk細胞中是一致的，如圖13b中所示。然而，遮蔽效率的降低并不一致地與結合強度降低的幅度相關。例如，y43a突變對結合有很小作用，僅顯示出8.1倍降低，而r36a突變導致結合顯著的～200倍下降。此外，盡管l42g變體具有與il-2弱35倍的結合，但仍保持其遮蔽作用幾乎與其野生型對應物相同，如在其對應的vitokine?p-0755的活性惰性中所見(圖13a和圖13b)。盡管基于先前的知識，這是出乎意料的，但多個實驗證實，il-2rαsushi中突變導致的結合強度變化并不一致地與其遮蔽能力的改變相關。這種不一致性可能歸因于vitokine形式中獨特的空間相互作用。因此，選擇il-2rαsushi?l42g變體作為il-2?vitokine的優選遮蔽部分結構域(d3)，這是由于其保留的遮蔽能力以維持對應vitokine的活性惰性，并且鑒于其與il-2的結合減弱，其在體內蛋白水解時容易擴散離開以實現完全活性的潛力。同時，當旨在調節il-2?vitokine的固有基礎活性，優化期望的抗腫瘤功效和潛在的全身毒性之間的平衡時，r36a或y43a可用作遮蔽部分結構域。另外，遵循相同的基本原理，與降低結合il-2的程度不同的其它il-2rαsushi變體，例如k38e，可用作il-2?vitokine的d3結構域。實施例8取代p65處的氨基酸令人驚訝地對與il-2rα結合產生了不同的影響由于il-2rα在調節性t細胞(treg)上高的和組成型表達，由il-2對treg的優先擴增代表了il-2對于癌癥免疫療法的不期望的作用。設計為減弱或消除與il-2rα結合的il-2變體將降低其對treg的響應性。不再與il-2rα結合的il-2變體預期不會優先活化treg，而僅在cd8+t細胞和nk細胞也被活化時的濃度活化treg。il-2分子的p65殘基與il-2rα界面上的關鍵殘基，特別是r36和l42，進行范德華相互作用。然而，它不與il-2rα形成鹽橋或氫鍵(xinquan?wang,等人,science(2005),310:1159-1163)。鑒于此，可以假設p65的變化僅會輕微地改變其與il-2rα亞基的相互作用，并且可能僅對結合產生最小的影響。然而，p65修飾對其與il-2rα相互作用的實際影響令人驚訝地多樣，從完全維持結合或甚至改善結合到減弱結合或完全消除結合。一組具有不同p65取代的il-2變體經由柔性的基于gs的接頭(seq?id?no:103)以二聚體形式或單體形式與fc融合。所有這些變體都含有活性中性的c125i突變，意圖增強它們的可開發性。然后使用elisa評估它們對il-2rα(cd25)的結合親和力。簡言之，將il-2rα-ecd以0.1μg/孔包被到孔上。在4℃孵育過夜并封閉后，以100μl/孔向每個孔添加系列稀釋的il-2fc融合蛋白。在室溫孵育1小時后，向每個孔添加100μl/孔的山羊抗人類igg?fc-hrp(在稀釋劑中1:5000稀釋)，并在室溫孵育1小時。在添加100μl?tmb底物后，將板在室溫在黑暗中顯影10分鐘，并添加100μl/孔的停止溶液。確定450nm處的吸光度，并使用prism軟件(graphpad)擬合曲線。elisa結合曲線圖示于圖14中。此外，il-2變體的elisa結合ec50值針對野生型(p-0531或p-0689，根據每種構建體的化合價)的elisa結合ec50值歸一化，詳見于表18。表18通過elisa評估具有p65突變的il-2變體與il-2rα的結合如圖14a和圖14b中所圖示，p-0608中的p65g突變、p-0633中的p65e突變和p-0706中的p65a突變似乎不損害與il-2rα亞基的相互作用。相反，當與它們各自的野生型il-2對照相比時，這些突變分別將對il-2rα的結合親和力增強18倍、10倍和10倍。在另一組中，il-2變體fc融合體，即p-0634、p-0708和p-0709，攜帶p65改變，導致與il-2rα亞基的鍵合發生不同水平的干擾。如圖14c中所顯示和表10中所詳述，p-0708中的p65n突變導致il-2rα結合的中度的8.6倍下降。另一方面，p65h(p-0634)和p65q(p-0709)改變具有更明顯的作用，分別導致結合的23倍和43倍減少。另一組p65取代，特別是p65r和p65k，在il-2和il-2rα相互作用中表現為產生急劇破壞，完全消除了p-0635、p-0704和p-0707與il-2rα的結合。這里，p-0635和p-0704是il-2p65r變體fc融合體的二聚體形式和單體形式，并且p-0707具有p65k氨基酸變化。圖14d揭示了即使在高達100nm的il-2rα濃度，這三種il-2突變蛋白fc融合體也幾乎沒有任何可檢測到的結合信號。這與攜帶已知消除結合的三個cd25破壞突變f42a/y45a/l72g的基準分子相當，如christian?klein等人,oncoimmunology(2017),6:3,e1277306中所記錄的。總之，p65殘基的改變導致對il-2rα結合的不同范圍的作用，包括增加、維持、減少或完全消除所得il-2變體與il-2rα的結合。由似乎非關鍵氨基酸的修飾引起的如此廣譜的結果不能由基于結構的誘變方法的預測產生。il-2rα結合的完全喪失是未預見的，也是現有技術無法預測的。鑒于p65突變僅修飾范德華相互作用表面的一小部分，這尤其令人驚訝。預期il-2rα結合強度的變化與活化treg細胞的il-2效力相關。為了驗證這一點，檢查了與il-2rα結合增強(p-0608)、結合降低(p-0634和p-0709)或結合消除(p-0635和p-0704)的il-2變體fc融合蛋白在cd4+treg細胞中差異刺激stat5磷酸化的能力。已知在il-2與跨膜il-2受體結合后，stat5參與下游信號傳導級聯。包括野生型il-2融合體p-0531和基準分子用于比較。使用轉錄因子foxp3在新鮮人類pbmc中測量淋巴細胞亞群中stat5的磷酸化，以在facs分析中鑒定treg群體。具體地，將純化的pbmc在macs緩沖液(miltenyi?biotech)中在4℃剝奪血清1小時，并隨后在37℃用測試化合物的系列稀釋液處理30分鐘。然后將細胞固定、透化、用特異性抗體染色，并按照實施例7中詳述的類似程序通過流式細胞術進一步分析。使用抗cd25-pe、抗foxp3-apc、抗pstat5-fitc和抗cd4-percp-cy5.5抗體(購自biolegend或bd?life?sciences)的混合物實現染色。將treg細胞亞群的流式細胞術數據門控為cd4+/foxp3+/cd25高組。數據表示為門控的群體中pstat5陽性細胞的百分比。如圖15中所圖示，il-2rα結合強度與刺激cd4+treg細胞中stat5磷酸化的效力之間存在明顯的相關性。圖15a中的化合物均以二價il-2變體為特征，而圖15b中的化合物均具有單體il-2變體。與p-0531相比，具有增強的il-2rα結合的p-0608展示出明顯更高的效力。與p-0531/p-0689相比，p-0626(圖15a)和p-0709(圖15b)與其il-2rα結合強度降低一致，顯示出pstat5效力降低。然而，其與il-2rα的剩余(盡管減少)結合確保比完全失去il-2rα結合的p-0635/p-0689和基準分子(化合價匹配)兩者更有效地活化treg。類似地，il-2rα結合的完全喪失導致treg效力向右約5log的顯著位移。這種剩余的treg信號傳導是由在treg細胞上發現的il-rβγ的活化引起的。此外，示例性il-2變體fc融合體(其包含使與il-2rα的結合增強、降低或消除的突變)均展示與il-2rβγ的結合未改變(圖16a)。它們在誘導cd8+t細胞中的ki-67表達方面也顯示出幾乎相等的效力(圖16b)。數據突出了il-2rα界面處的il-2突變，無論其對il-2rα結合的影響如何，都不會改變與il-2rβγ的相互作用的事實。實施例9鑒定作為vitokine的活性部分結構域的具有最佳il-2rα結合的il-2變體il-2?vitokine構建體的活性部分結構域(d2)選自實施例8中鑒定的與il-2rα具有不同水平結合強度的一組il-2變體。在vitokine中摻入il-2rα結合減少或消除的il-2變體可降低腫瘤附近蛋白水解活化后對treg的反應性。然而，鑒于d2和d3之間的結合被認為是vitokine的遮蔽能力所必需的，因此必須在減弱的il-2rα結合程度和遮蔽效率之間實現平衡。四種示例性il-2?vitokine，即p-0800、p-0830、p-0831和p-0802，均含有作為d1結構域的抗小鼠pd1抗體p-0722(seq?id?no:52、189和190)、作為遮蔽部分結構域(d3)的il-2rαsushi?l42g變體(seq?id?no:184)、作為l1接頭的不可裂解接頭(seq?id?no:103)和作為l2接頭的mmp-2/9可裂解接頭(seq?id?no:84)。如表19中詳述的，活性結構域(d2)包含p-0800中的p65r突變、p-0830中的p65n突變和p-0831中的p65q突變。p-0802具有il-2野生型等同物作為d2結構域。使用新鮮人類pbmc評估示例性vitokine誘導cd8+t細胞(圖17a)和nk細胞(圖17b)上的ki67表達的能力。p-0782是p-0800的非vitokine免疫細胞因子對應物，含有單體il-2p65r變體，被包括作為完全活性的il-2參考。這些化合物在刺激nk細胞中的ki67表達方面的ec50值，以及它們與p-0782相比的變化倍數總結在表19中。數據揭示，當d2結構域是野生型il-2時，vitokine構建體(p-0802)的d3結構域使活性大致3-log降低，表明d3結構域強大的遮蔽能力。相反，對于摻入具有il-2rα結合消除的il-2變體(p65r)的p-0800，活性僅有10倍至20倍降低，表明由于d2結構域和d3結構域之間不存在結合，d3的遮蔽能力顯著減弱。令人感興趣地，當在p-0830和p-0831中使用具有il-2rα結合中等降低的il-2變體(如p65n和p65q)時，d3結構域提供了與其促進野生型il-2相當或僅略微低于其促進野生型il-2的遮蔽效率。表19含有具有不同il-2rα結合強度的il-2變體的il-2?vitokine的活性比較假設d2結構域和d3結構域之間的結合親和力閾值以及結合界面的理想空間構型在決定il-2?vitokine的遮蔽效率中是關鍵的。鑒于il-2?p65q變體表現出與il-2rα的顯著降低的結合強度(如圖14c和表18中所描繪)，并且仍然被il-2rαsushi?l42g有效遮蔽以保持作為vitokine的惰性，選擇il-2?p65q變體作為il-2?vitokine設計的優選d2結構域。由于d2結構域和d3結構域之間的結合減少，預期d3結構域將在蛋白酶裂解后容易擴散離開。還預期，一旦生物活性在蛋白水解活化后完全恢復，與野生型相比，該變體將具有顯著降低的刺激treg細胞的能力，如圖15b中所圖示。然而，也可以考慮具有降低的il-2rα結合的其他il-2變體，諸如p65h和p65n，以在期望的抗腫瘤功效和潛在全身毒性最小化之間實現正確的平衡。除了p65突變以實現由il-2rαsushi的減弱結合和有效遮蔽之間的平衡之外，可以將改變il-2對il-2rβγ的結合親和力的另外的突變摻入vitokine的d2結構域中。這些突變調節il-2在主要表達β和γ受體亞基的細胞(諸如cd8+t細胞和nk細胞)中的總體響應。通過這種策略，可以微調vitokine的固有基礎活性以及它們在蛋白水解活化后的活性。實施例10用于總體效力減弱的具有il-2rβγ破壞取代的il-2變體通過檢查il-2/il-2r共晶體結構(pdb代碼2b51)來獲取破壞il-2rβ和共同γ鏈(γc)的突變的選擇的信息。取代直接與il-2rβ相互作用的能量熱點殘基，諸如d20和n88，可能導致活性顯著降低，使得效力較差。因此，在il-2/il-2rβ界面處的非關鍵殘基諸如l19處引入取代。l19殘基僅與il-2rβ發生范德華相互作用，并且預期所得突變體僅稍稍調節而不是顯著降低il-2的功能活性。此外，用非脂肪族殘基替換l19消除了提出的可能導致il-2的血管毒性的“19ldl”基序(baluna?r,rizo等人,proc?natl?acad?sci?1999；96:3957-62)。將示例性il-2rβ破壞突變l19h、l19q、l19y與p-0704中的p65r和c125i的突變背景一起引入il-2中，以構建單體il-2fc融合體。p65r突變導致il-2rα結合的完全喪失，并且c125i修飾是出于可開發性目的而進行，并且這些變化均不影響il-2對il-2rβγ的功能活性。通過流式細胞術評估所得融合蛋白，即p-0731、p-0759和p-0761刺激人類cd8+t細胞和nk細胞上的ki67表達的效力。結果描繪于圖18a和圖18b中，并在表20a中詳述。當與p-0704相比時，所有變體均顯示出它們促進人類cd8+t細胞和nk細胞增殖的能力降低。具體地，p-0759(l19q)和p-0761(l19y)表現出適中的效力3倍下降，而p-0731中的l19h突變導致更顯著的效力18-25倍下降。效力降低也可以通過摻入其他l19突變諸如l19d、l19r和l19s來實現。表20a含有l19突變的il-2變體的示例性fc融合體及其離體活性同樣，在q126(與γc相互作用不可或缺的殘基)處進行氨基酸取代以減弱il-2與γc的相互作用。所有這些突變也以p65r和c125i的突變背景引入il-2中。含有q126突變的單體il-2變體的fc融合體列于表20b中。與p-0704相比，響應于這些il-2變體的人類cd8+t細胞和nk細胞的ki67表達的增加描繪在圖19a至圖19f中，并且還總結在表20b中。il-2q126突變對cd8+t細胞和nk細胞增殖有不同程度的影響。對于cd8+t細胞(圖19a、圖19c和圖19e)，q126n、q126h、q126m、q126f、q126w和q126y顯示出輕微的1.5-5倍降低；觀察到q126r、q126g、q126s中度的5-20倍降低；注意到包括q126a、q126v、q126e、q126e、q126l和q126t的突變的顯著的20-50倍下降；觀察到q126p和q126i的更劇烈的下降(>50倍)；并且q126d完全消除了活性。由于q126突變，在nk細胞中觀察到效力變化的相當的趨勢(圖19b、圖19d和圖19f)。表20b含有q126突變的il-2變體的fc融合體及其離體活性*變化倍數為與每個單獨實驗中的p-0704的ec50值相比較。il-2效力可以通過組合il-2rβ和γc破壞突變來進一步微調，如p-1247(il-2結構域seq?id?no:173)與p-1158和p-0704相比所示。除了p-0704中的p65r和c125i突變外，p-1158含有q126n突變，并且p-1247含有l19y和q126n突變。如圖20a所示出，對于刺激人類cd8+t細胞中的ki67表達，在p-1247中摻入l19y突變導致與p-1158相比效力的加性2.6倍降低(9.2nm對比3.6nm)，并且與p-0704相比組合的效力4倍降低(9.2nm對比2.3nm)。用nk細胞觀察到類似的趨勢(圖20b)。如本領域技術人員將理解的，組合位置l19和q126處的不同突變可以導致不同程度的活性調節，并且在本發明的精神和范圍內。總之，除了在il-2中使用il-2rα破壞取代以限制免疫抑制性treg的不期望的擴增之外，整合il-2rβγ破壞取代提供了減弱總體效力以獲得最佳活性的方法。通過在l19或q126處引入特定突變，可以實現不同程度的效力。il-2的期望效力可以通過對l19和q126位置處突變的組合進行細致地微調。降低的效力有助于避免該途徑的過度途徑活化并使不期望的靶沉沒最小化。因此，該策略可以潛在地降低與il-2治療相關的毒性，并改善藥代動力學和藥效學。在vitokine中摻入效力降低的il-2有助于微調其固有基礎活性以及它們蛋白水解活化后的活性。實施例11使用優化的pd1阻斷抗體和優選的il-2和il-2rαsushi結構域構建pd1?ab-il-2vitokine阻斷pd1并因此繞過腫瘤微環境中的免疫抑制作用的抗體可以加強il-2響應并進一步增強針對腫瘤的免疫。作為d1結構域用于構建pd1?ab-il-2?vitokine的pd1抗體選自包含seq?id?no:44中列出的輕鏈序列和seq?id?no:45-49中列出的重鏈序列的優化的人類pd1阻斷抗體。這些優化的pd1阻斷抗體對人類pd1蛋白具有高親和力，并且在阻斷pd1方面表現出與帕博利珠單抗相等或相當的效力。它們還具有更高的與其最接近的人類種系序列的序列相似性評分，導致與帕博利珠單抗相比提高的人源性程度。此外，預測它們具有較低的疏水性，這繼而可能比帕博利珠單抗降低它們的聚集傾向。預計使用這些優化的pd1阻斷抗體構建的pd1靶向性il-2?vitokine也具有增強的可開發性譜。表21列出了示例性pd1?ab-il-2?vitokine，其結構描繪于圖3a中。所有示例性vitokine包含具有或不具有調節對il-2rβγ的活性的突變的il-2?p65q變體作為活性部分結構域(d2)，il-2rαsushi?l42g變體作為遮蔽部分結構域(d3)，和連接d2結構域與d3結構域的可裂解的l2接頭(seq?id?no:84)。然而，當期望調節il-2?vitokine的固有基礎活性時，其它il-2rαsushi變體，例如r36a，可用作遮蔽部分結構域。另外，連接pd1?ab和il-2的l1接頭也可以是可裂解的。可裂解接頭的組成可以通過使用seq?id?no:78-94中列出的各種序列進一步優化，以更好地適合不同的疾病適應癥和/或階段。表21a示例性人類pd1?ab-il-2?vitokine對所有基因進行密碼子優化以便在哺乳動物細胞中表達，其經由genscript的服務合成并亞克隆到接受者哺乳動物表達載體中。按照制造商的說明，通過與哺乳動物表達載體共轉染expi293細胞(thermofisher)來產生vitokine構建體。按照實施例2中詳述的相同程序進行蛋白質純化和表征。發現包含優化的抗體序列的pd1?ab-il-2?vitokine(包括p-1197、p-1239和p-1272)以顯著高于包含參考抗體p-0734的p-1120的水平表達。在使用相同批次的expi293細胞的相同瞬時表達條件下，p-1197、p-1239和p-1272以137-150mg/l的滴度表達，相比于p-1120的滴度為60mg/l。數據表明，具有消除潛在序列缺陷的優化序列的pd1阻斷抗體可能導致對應的vitokine構建體改進的可開發性特性。因為這些優化的pd1抗體不與小鼠pd1反應，所以類似地產生替代物小鼠pd1-ab-il-2vitokine和另外的對照。這些用于體內研究，特別是用于免疫活性小鼠的藥代動力學(pk)/藥效學(pd)和腫瘤實驗。表21b提供了關于這些分子的詳細信息。此表中列出的每種vitokine構建體均摻入相同的d3結構域(seq?id?no:184)。除了p-0871之外，這些vitokine含有小鼠pd1抗體p-0722(seq?id?no:189、190和52)作為d1結構域。p-0871是p-0831的非靶向vitokine對應物，含有種系抗體p-1260(seq?id?no:192、193和194)作為d1結構域。p-0877是不可裂解的vitokine，并且p-0838缺少l2接頭和d3并且其結構圖示于圖3b中，充當p-0831的非vitokine免疫細胞因子對應物。表21b示例性替代物小鼠pd1?ab-il-2?vitokine和對照分子雖然p-0831是用于以下實施例的體內研究的主要對象，但當適當地調整劑量時，預測含有具有額外突變以靶向il-2rβγ的il-2變體的其他vitokine(諸如表21b中列出的那些)可實現類似的抗腫瘤有效性。由于il-2?vitokine的固有基礎活性與其活性結構域(d2)的活性直接相關，因此減弱的d2活性和成比例調節的vitokine的基礎活性使得能夠施用更高劑量而沒有不良作用。這有助于充分支持pd1抗體的逆轉t細胞無反應性或耗盡的功能，從而潛在地增強與il-2免疫療法的協同作用并擴大治療窗口。實施例12pd1?ab-il-2?vitokine的離體活性和體外蛋白水解活化pd1抗體在摻入pd1?ab-il-2?vitokine時保留其結合和功能活性是重要的。優越的靶結合和pd1阻斷功能的pd1抗體可增強til靶向的特異性和選擇性，并通過高效逆轉t細胞無反應性和耗盡，進一步與il-2抗癌免疫應答協同作用。在使用螢光素酶報告物測定的比較分析中，示例性vitokine?p-1197、p-1239和p-1272的pd1抑制能力針對它們各自的pd1阻斷抗體p-1174、p-1238和p-1271設定。如圖21a和圖21b中所圖示，三種抗體中的每一種，當摻入到它們對應的vitokine構建體中時，不僅保持了它們的阻斷效力，而且還略微改善了阻斷效力。例如，pd1抗體p-1174、p-1238和p-1271阻斷pd1/pd-l1相互作用，ec50值分別為1.29nm、1.82nm和1.53nm。另一方面，它們對應的vitokine?p-1197、p-1239和p-1272在阻斷效率方面展示出1.5-2倍細微增強，ec50值分別為0.92nm、1.27nm和1.20nm。此外，在vitokine形式中，emax和誘導倍數兩者均增加了11％-17％。圖22還證實了il-2的活性仍然被il-2rαsushi結構域有效遮蔽，而與特定pd1抗體組成無關。示例性pd1?ab?il-2?vitokine?p-1197、p-1272和p-0872(它們的區別僅基于它們不同的pd1阻斷抗體)(詳見表21a中)當與p-0879(圖22a和圖22b)或p-1273(圖22c和圖22d)相比時，它們誘導cd8+t細胞和nk細胞增殖的能力都顯示出大約300倍降低。對于背景，p-0879和p-1273分別是p-0872和p-1272的缺乏遮蔽性d3結構域的非vitokine免疫細胞因子對應物。ec50值可見于表22中。對于cd8+t細胞，vitokine的低效力阻止了曲線擬合，僅得到近似的ec50值。p-1174是p-1197的pd1抗體組分，并且作為陰性對照被包括在內。表22示例性pd1?ab-il-2?vitokine與其非vitokine免疫細胞因子對應物相比的ec50值進一步評估p-1272的體外蛋白水解活化。與本發明中的其他示例性pd1?ab-il-2vitokine一致，p1272含有單個mmp-2/9可裂解的l2接頭(seq?id?no:84)。在程序中，首先根據制造商的說明將3.3μg的潛伏性mmp-2(biolegend)以apma(millipore?sigma)活化，然后將其交換緩沖液，并添加到0.4ml制造商推薦的測定緩沖液(100mm?tris、20mm?cacl2、300mm?nacl、0.1％(w/v)brij?35，ph?7.5)中的120μg?p-1272中。在37℃孵育3小時后，然后使用蛋白a樹脂(mabselect?sure；cytiva)以結合洗脫模式純化處理的樣品。在還原性sds-page凝膠中分析洗脫的樣品，并在離體功能測定中評估其生物功能。圖23a圖示了p-1272的遮蔽部分結構域被有效且完全裂解，產生p-1272-活化，其對應于圖2中描繪的活性形式2。有效的體外蛋白水解導致il-2活性的完全恢復，示例為p-1272-活化和p-1273在誘導新鮮人類pbmc的cd8+t細胞中ki67的劑量依賴性表達方面的不可區分的活性(圖23b)。用其他pd1?ab-il-2?vitokine觀察到相當的發現，如p-0831所例示，并在圖23c中描繪。此外，p-1345(pd1?ab-il-2?vitokine的不同形式)與其他vitokine的不同之處在于其包含可裂解的l1接頭(seq?id?no:84)和不可裂解的l2接頭(seq?id?no:115)。p-1345類似地通過體外蛋白酶裂解活化，并且分離出其唯一的活化形式，在圖2中稱為活性形式1。然后評估該形式在人類pbmc的cd8+t細胞中誘導ki67表達的效力。如圖23d中所顯示，與其完整的vitokine形式相比，蛋白水解活化導致活性約50倍增加。然而，活化沒有完全恢復il-2結構域的活性，顯示出其活性為其非vitokine對應物p-0838的6倍低，相應的ec50值為8.29nm和1.34nm。這些結果意味著采用可裂解的l2接頭比可裂解的l1接頭更有利。這是因為源自l2接頭裂解的活性形式2是與pd1?ab融合的完全功能il-2結構域。這種形式可以激活疾病部位附近表達pd1的t細胞中的il-2r信號傳導，增強兩種途徑并協同抗癌免疫應答，同時降低全身毒性。另一方面，活性形式1表現出降低的效力、較短的半衰期和缺乏til靶向能力。這些觀察結果還表明，遮蔽結構域本身不足以有效遮蔽活性結構域，導致大約6倍的適中遮蔽效率。為了有效遮蔽il-2活性，該結構必須是本文以及由本發明人在wo2019246392和wo2021119516中公開的vitokine平臺的形式，其包括靶向結構域(d1)和遮蔽結構域(d3)兩者的偶聯。實施例13pd1-ab-il-2?vitokine在非荷瘤小鼠中延長的體內半衰期vitokine的il-2結構域被設計成保持惰性，直到被患病組織中上調的蛋白酶局部活化。結果，預期il-2?vitokine與外周和非病變組織中細胞表面上il-2受體的結合將顯著減少。這將減輕潛在的抗原沉沒和/或靶介導的沉積，從而延長體內半衰期。進行了一項研究以比較小鼠pd1?ab?il-2?vitokine?p-0831與其非vitokine免疫細胞因子對應物p-0838在非荷瘤c57bl/6小鼠中的藥代動力學。7周齡的初始雌性c57bl/6小鼠從charles?river實驗室接收。在開始研究之前，他們被允許在機構內適應7天。在開始時，p-0831和p-0838各自以1mg/kg的劑量通過靜脈內注射施用。媒介物(pbs)被包括在內作為陰性對照。通過面頰采血在注射后10分鐘、2小時、6小時、24小時、48小時、72小時、120小時、168小時、240小時和360小時抽取血液樣品。每組由3只小鼠組成，并且每周或每三天采血一次，最大頻率為每組兩次。使用elisa測定確定化合物的血清濃度。針對p-0831開發了三種不同的elisa方法以測量：1)總vitokine濃度(包括活化形式和完整形式)；2)完整vitokine的濃度；和3)活化的vitokine的濃度。對于所有三種方法，maxisorp板在4℃用小鼠pd1蛋白(r&d?systems)包被過夜。隨后，用superblock(thermofisher)封閉板。將各種稀釋度的血液樣品添加至板并在室溫孵育1小時。對于總vitokine檢測，添加抗il-2山羊多克隆抗體(r&d?systems)，然后添加第二hrp綴合的驢抗山羊igg(thermofisher)。為了檢測完整的vitokine，使用多克隆抗cd25抗體(r&d?systems)，其使用hrp綴合的鏈霉親和素蛋白(thermofisher)探測。對于活化的vitokine檢測，應用生物素化的單克隆抗il-2抗體(bd?pharmingen)，與hrp綴合的鏈霉親和素配對。對于p-0838檢測，使用用于檢測總vitokine濃度的相同抗il-2山羊多克隆抗體(r&d?systems)，然后使用驢抗山羊igg-hrp。使用ultra?tmb底物溶液顯影所得信號，并從graphpad?prism中的非線性回歸曲線擬合推斷值。如圖24中所示出的，完整p-0831和總(包括完整和活化形式)p-0831的濃度分布緊密對齊，表明p-0831主要以其完整狀態循環。此外，在施用后的任何時間點處都沒有檢測到活化的p-0831的證據，證實了p-0831在外周保持完整的觀點。與1mg/kg劑量后360小時仍可測量的p-0831的濃度分布相反，p-0838的血清濃度快速下降。在給藥后72小時，p-0838顯著降低，并且在給藥后120小時檢測不到。圖24中的灰色水平虛線表示血清p-0838水平的定量下限(lloq)。對于低于lloq的測量，值指定為10-3nm。這些發現有力地支持了vitokine形式在延長活性結構域的體內半衰期方面是優越的觀點。vitokine的引人注目的延長的體內半衰期被認為是由外周血中il-2結構域的惰性引起的。這種無活性可能減少了與外周組織和非患病組織兩者中細胞表面上的il-2受體的相互作用，顯著降低了細胞活化和擴增，并因此減輕了潛在的抗原沉沒和/或靶介導的沉積。實施例14pd1-ab-il-2?vitokine在非荷瘤小鼠中的最小化全身藥效學作用vitokine平臺旨在減輕全身中靶毒性，并擴大用于細胞因子療法的治療窗口。這是通過使活性細胞因子在構建體內變成惰性來實現的，這防止了其與外周血中或非患病細胞表面上的受體相互作用。這種設計有助于限制細胞因子途徑的過度活化，并降低“組織外”位置中不期望的“中靶”效應的風險。為了評價該假設，將小鼠pd1?ab-il-2?vitokinep-0831施用到非荷瘤c57bl/6小鼠中，以通過監測給定時間段內外周血淋巴細胞的增殖和擴增來評估其與其非vitokine免疫細胞因子對應物p-0838相比的全身作用。7-9周齡之間的初始c57bl/6小鼠經由單次腹膜內注射施用2mg/kg和10mg/kg的p-0831以及0.3mg/kg、1mg/kg和2mg/kg的p-0838(n＝4只只/組)。媒介物(pbs)被包括在內作為陰性對照。在給藥后第0天、第3天、第5天、第7天和第10天將血液樣品收集到肝素管中用于免疫表型分型。隨后，用一組靶向常見表面免疫細胞標志物的抗體對肝素處理的血液樣品進行染色。在使用bd?pharmingen裂解緩沖液裂解紅細胞后，通過用臺盼藍排除死細胞來確定存活的單核血細胞的總數。然后將裂解的免疫細胞在室溫在黑暗中使用固定/透化緩沖液(ebioscience)進行30分鐘的固定和透化。洗滌后，用ki67增殖標志物的抗體對這些細胞進行細胞內染色。鑒定不同的免疫細胞亞群，并使用流式細胞儀(beckton?dickinson)定量它們在循環中的絕對計數。這使用市售可得的抗體，即cd3-apc.cy7、cd8-percp-cy5.5、cd335-apc、cd45-af700、cd4-bv421、cd25-bv510、foxp3-fitc、ki67-pe和顆粒酶b-bv421來完成。使用flowjo軟件進行流式細胞術分析，并使用graphpad?prism繪制結果。在圖25中，數據揭示p-0838在1mg/kg和2mg/kg的劑量顯著擴增外周血cd8+t細胞(圖25a)和顆粒酶b+cd8+t細胞(圖25b)，表現出劑量依賴性響應。具體地，用2mg/kg劑量的p-0838，cd8+t細胞從900個細胞/μl的基線水平擴增至第3天的2400個細胞/μl(2.7倍的增加)。擴增在第5天達到峰值，為4200個細胞/μl(4.7倍的增加)，之后在第7天下降到接近基線水平。用1mg/kg劑量的p-0838，在第3天觀察到cd8+t細胞擴增的峰值擴增，為2.3倍增加，并在第7天回到接近基線水平。在較低劑量的0.3mg/kg的p-0838，cd8+t細胞擴增僅略微明顯。在細胞毒性顆粒酶b+cd8+t細胞的擴增中觀察到類似的趨勢(圖25b)。形成鮮明對比的是，即使在2mg/kg和10mg/kg的較高劑量，vitokine?p-0831在整個10天的時間段也未顯示出cd8+t細胞或顆粒酶b+細胞的顯著擴增(圖示于圖25a和圖25b中)。與離體測定結果一致，對于il-2處理，nk細胞展示出比cd8+t細胞更高的反應性。這從用0.3mg/kg劑量的p-0838觀察到的顯著nk細胞擴增是明顯的(圖25c)。nk細胞擴增在0.3mg/kg和1mg/kg劑量之間顯示出劑量依賴性，在1mg/kg和2mg/kg劑量之間沒有顯著差異。在跨所有三個劑量的p-0838中，nk細胞的峰值擴增在第3天(圖25c)。在細胞毒性顆粒酶b+nk細胞的擴增中觀察到類似的模式(圖25d)。相比之下，即使當以相當高的10mg/kg劑量施用時，p-0831處理僅導致nk細胞和顆粒酶b+nk細胞兩者的數量輕微且延遲的增加(圖25c和圖25d)。總之，當與活性il-2融合分子p-0838相比時，p-0831表現出顯著減少的特異性淋巴細胞的全身增殖和擴增。這突出了vitokine形式在遮蔽il-2活性方面的有效性，從而防止il-2途徑的不期望的活化并減輕“組織外”中不期望的“中靶”作用的風險。實施例15減輕pd1?ab-il-2?vitokine在小鼠中的細胞因子相關毒性細胞因子相關毒性，也稱為細胞因子釋放綜合征(crs)，是與癌癥免疫療法相關的主要風險之一。crs源于強烈的免疫應答，并通常與幾種細胞因子升高的循環水平有關，包括白介素-6和干擾素γ(infγ)。隨著基于免疫的療法效力的增加，免疫活化的幅度可能超過在更天然環境中發生的水平，潛在地將crs遞增到危及生命的水平。鑒于vitokine平臺被設計為限制細胞因子途徑的過度活化，并且考慮到示例性il-2?vitokine?p-0831已證實的使靶向淋巴細胞群體的全身活化和擴增最小化的能力(參見實施例14)，vitokine為顯著降低細胞因子相關毒性帶來了前景。為了研究降低細胞因子相關毒性的潛力，將小鼠pd1?ab-il-2?vitokine?p-0831及其非vitokine免疫細胞因子對應物p-0838以不同劑量施用至非荷瘤初始c57bl/6小鼠中。隨后，確定關鍵血清炎性細胞因子之一infγ的循環水平。將7-9周齡的初始c57bl/6小鼠分組，并且每組3只(n＝3)，給予單次腹膜內注射劑量為1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg、10mg/kg和20mg/kg的p-0831和劑量為1mg/kg、3mg/kg和6mg/kg的p-0838。包括媒介物(pbs)和小鼠pd1抗體p-0722(含有具有seq?id?no:52和53的同源二聚體fc)作為陰性對照。在處理后48小時從小鼠收集并分離血清樣品。按照制造商的說明，使用小鼠infγduoset?elisa試劑盒(r&d?systems)來確定血清ifnγ濃度。圖26a和隨附的表23揭示了p-0831和p-0838處理兩者均導致血清ifnγ水平的劑量依賴性增加。然而，與p-0838相比，vitokine?p-0831表現出顯著降低的ifnγ血清水平。在1mg/kg劑量，p-0838處理導致了253pg/ml的infγ濃度，而p-0831只導致了僅僅10.6pg/ml的infγ濃度。更引人注目的是，在3mg/kg劑量的p-0838，血清infγ上升至12482pg/ml，是用1mg/kg劑量所見水平的50倍。相反，當以3mg/kg給藥時，p-0831與其1mg/kg劑量相比僅顯示infγ水平2.5倍增加。令人驚訝的是，即使當以20mg/kg劑量施用時，p-0831僅導致182pg/ml的適中infγ水平，這仍然低于用1mg/kg劑量的p-0838所見的水平。如預期的那樣，媒介物和抗體處理均未誘導該炎性細胞因子的任何可辨別的釋放，如圖26a中所圖示。表23處理后48小時血清infγ濃度在3mg/kg和6mg/kg劑量的p-0838處理組中觀察到的循環infγ水平急劇增加，這是由高水平的全身性免疫活化引起的，可導致嚴重毒性。在同時進行的實驗中，經由腹膜內注射向初始c57bl/6小鼠(7-9周齡，n＝4只/組)施用劑量為3mg/kg、6mg/kg和20mg/kg的p-0831和劑量為1mg/kg、3mg/kg和6mg/kg的p-0838。在用3mg/kg和6mg/kg?p-0838處理的小鼠中，此類細胞因子相關毒性作用伴隨著顯著的體重減輕(圖26b)和其他應激跡象。鑒于經建立的方案必須處死任何經歷體重超過10％減輕的小鼠，p-0838?6mg/kg處理組中的所有小鼠均未存活超過4天，并且3mg/kg?p-0838組中的4只小鼠中的3只必須在單次注射后的第4天被處死。相反，跨所有測試劑量(甚至高達20mg/kg)用p-0831處理的小鼠在q2w給藥時間表的3個劑量后仍然存活，并且沒有表現出顯著的體重減輕(圖26b)。這表明vitokine平臺呈現顯著較低的毒性譜。綜上所述，pd1?ab?il-2?vitokine明顯減輕了小鼠中的細胞因子相關毒性，如以infγ示例的炎性細胞因子的循環水平顯著降低所證明的，并且與非vitokine免疫細胞因子對應物相比，即使在高得多的劑量體重變化也極小。pd1?ab-il-2?vitokine平臺有效地將脫靶毒性最小化，從而提供更廣泛的治療窗口。此外，pd1?ab?il-2?vitokine在升高得多的劑量被耐受的能力在優化給藥方案方面提供了更大的靈活性。在較高的劑量，pd1抗體的逆轉t細胞無反應性或耗盡的功能由于劑量水平在其有效范圍內因此可以被完全實現，潛在地增強與il-2免疫療法的協同作用。另外，通過引入破壞il-2rβ或γc相互作用的突變實現的具有效力降低的il-2摻入將導致具有較低固有基礎活性的vitokine，并且還可能潛在地拓寬治療邊界。實施例16通過pd1?ab-il-2?vitokine抑制小鼠已建立的腫瘤的生長在同基因mc38鼠結腸癌模型中，研究了pd1?ab?il-2?vitokine?p-0831與其非vitokine免疫細胞因子對應物p-0838相比的抗腫瘤功效。在這些實驗中，在7-9周齡之間的雌性c57bl/6小鼠的右側腹皮下植入5×105個mc38結腸癌細胞。大約2周后，一旦腫瘤已生長到約～75mm3的平均體積，在研究第0天，將小鼠隨機分成8只小鼠的組。在研究第1天，給予如下處理：9mg/kg的小鼠pd1抗體p-0722、不同給藥水平(3mg/kg、6mg/kg和9mg/kg)的p-0831和1mg/kg的p-0838。這些處理每10天一次(q10d)腹膜內給予，總共2個劑量。媒介物(pbs)用作對照。每周兩次監測腫瘤生長和小鼠的體重兩者。使用卡尺測量確定腫瘤體積(tv)并計算為：體積＝0.5x(寬度)2x(長度)。使用下式計算腫瘤生長抑制(tgi,％)：tgi(％)＝[1-(處理組的tv)/(對照組的tv)]×100(％)。基于已建立的標準，如果腫瘤生長至或超過1500mm3或腫瘤變得壞死，對小鼠實施安樂死。圖27a-圖27d圖示出了含有il-2部分的四個不同處理組的個體小鼠的腫瘤生長曲線。圖中的每條線代表一只小鼠，并且媒介物組的平均腫瘤生長由虛線代表。x軸下方的小箭頭表示每個劑量。用6mg/kg的p-0831處理顯示了最顯著和持續的作用，來自該組的所有8只小鼠在第45天完全根除了腫瘤生長，這是在第二次且最后一次處理后34天(圖27b)。同樣，在用9mg/kg的p-0831處理的組中，8只小鼠中的7只在研究結束時保持無腫瘤(圖27c)。另一方面，以3mg/kg施用的p-0831具有稍低的功效，其中8只小鼠中有5只保持無腫瘤，而3只小鼠在腫瘤生長延遲的初始階段后顯示出腫瘤生長(圖27a)。對于用1mg/kg?p-0838處理的小鼠，根據研究結論，8只小鼠中有6只無腫瘤(圖27d)。圖27e中還圖示了各組的平均腫瘤體積以及平均值的標準誤差(sem)隨時間的變化。用媒介物處理的小鼠快速發展了大的皮下腫瘤。pd1抗體處理顯示出有限的有效性，當與媒介物組相比時，導致27％的腫瘤生長抑制(tgi)。相反，所有其他處理組表現出抑制腫瘤生長的高功效，在處理開始后第45天100％?tgi。圖27f示出，即使在顯著高于p-0838的劑量，p-0831仍得到了良好的耐受，體重減輕很少或沒有體重減輕。先前顯示出p-0838在3mg/kg或更高的劑量不耐受(如圖26b中所示出)。組合的體內發現指示，6mg/kg劑量的p-0831導致更明顯和更延長的應答。值得注意的是，當與1mg/kg劑量的p-0838的效果相比時，這種抗腫瘤功效的實現伴隨著低得多的外周淋巴細胞增殖和擴增(如圖25中所示)以及顯著減少的循環infγ的產生(圖26)。這種功效部分歸因于vitokine形式提供的高劑量耐受性。因此，pd1?ab-il-2?vitokine平臺提供了更寬的治療窗口，使抗體組分能夠完全實現其逆轉t細胞無反應性和耗盡的潛力。在并行研究中，利用免疫組織化學(ihc)以評估pd1?ab-il-2?vitokine對處理后5天獲得的腫瘤組織的影響。在這種設置中，mc38皮下腫瘤被類似地建立。在隨機化后(5只小鼠/組)，用單一劑量的媒介物、p-0722(6mg/kg)、p-0831(6mg/kg)或p-0838(1mg/kg)處理小鼠。處理后5天，將小鼠安樂死，提取腫瘤，并制備組織樣品。將組織切片固定在10％福爾馬林中，石蠟包埋，處理，并通過histowiz按照制造商的說明用抗體染色，以評價腫瘤組織中的免疫細胞。每組的代表性ihc圖像圖示于圖28中。圖28展示了p-0831處理引起cd3+t細胞和cd8+t細胞廣泛浸潤到腫瘤組織中。此外，浸潤的cd8+t細胞的特征在于強的細胞毒性能力，這由強烈的顆粒酶b表達證明。這些觀察結果突出了p-0831處理的小鼠腫瘤中細胞毒性cd8+t細胞的擴增數量和活性，還驗證了抗腫瘤功效數據。形成鮮明對比的是，6mg/kg的小鼠pd1抗體p-0722僅誘導極小的腫瘤浸潤性淋巴細胞(til)出現。雖然p-0838處理導致有限的t細胞浸潤，但它確實顯示了高顆粒酶b表達。重要的是，沒有處理顯著導致抑制性foxp3+細胞出現。總之，以替代物分子p-0831示例的pd1?ab?il-2?vitokine通過促進細胞毒性t細胞廣泛浸潤到腫瘤組織中而有效地抑制腫瘤生長，同時最小化外周淋巴細胞的增殖和擴增。因此，使用vitokine形式可以減輕通常與完全活性細胞因子相關的問題，諸如免疫途徑的過度刺激、不期望的“組織外”“中靶”毒性和不期望的靶沉沒，同時仍然顯示出強的抗腫瘤功效。重要的是，pd1?ab-il-2?vitokine與更高劑量的相容性確保抗體臂可以最佳地靶向和逆轉t細胞無反應和耗盡，增強現有的免疫應答。這將導致免疫系統抗腫瘤活性的進一步增強。另外，通過引入破壞il-2rβ或γc相互作用的突變實現的效力降低的il-2的摻入導致具有較低固有基礎活性和活化后活性的vitokine。這還可能潛在地擴大治療邊界。實施例17pd1?ab-il-2?vitokine的體內活性取決于蛋白水解活化并依賴于pd1靶向通過使用鼠ct26結腸癌腫瘤模型比較p-0831及其不可裂解的vitokine對應物p-0877，研究了vitokine活化在其抗腫瘤功效中的關鍵作用。p-0831和p-0877之間的唯一區別在于連接il-2(d2)和il-2rα(d3)結構域的l2接頭(詳見表21b)。雖然p-0877在誘導人類pbmc中的cd8+t細胞和nk細胞中的ki67表達方面展示出與p-0831相同的活性，如圖29a和圖29b中所描繪的，但p-0877中的il-2結構域保持遮蔽且無活性，因為d3結構域不能被裂解導致活化。對于本研究，在7-9周齡的雌性balb/c小鼠的右側腹皮下注射5×105個ct26細胞。在第11天，當平均腫瘤體積達到約75mm3時，將小鼠隨機分為五組，每組包含八只動物。在第一個研究日(即隨機分組后的第二天)開始，它們接受媒介物(pbs)、或10mg/kg的p-0722、p-0831、p-0877的兩次q12d腹膜內注射。每周兩次監測腫瘤尺寸和體重。基于已建立的標準，如果腫瘤生長至或超過1500mm3或腫瘤變得壞死，對小鼠實施安樂死。與mc38模型相比，ct26同基因腫瘤模型通常對pd1療法的響應較低。如圖29c中所描繪，腫瘤最終在所有小鼠中發展。當用小鼠pd1抗體p-0722處理時，腫瘤生長僅有輕微延遲，導致25％的腫瘤生長抑制(tgi)。另一方面，以相同劑量施用p-0831展示出顯著改善的功效，顯示出81％的tgi。形成鮮明對比的是，具有不可活化的惰性il-2結構域的p-0877在抑制腫瘤生長方面相比于p-0722沒有展示出任何改善。這些發現表明，vitokine分子增強的抗腫瘤有效性取決于接頭的酶促裂解以釋放遮蔽部分，從而在腫瘤周圍活化il-2結構域。值得注意的是，當以10mg/kg給予時，所有測試的化合物都是耐受良好的，沒有小鼠體重減輕的證據，如圖29d中所示出。在使用ct26腫瘤模型同時進行的研究中，評估了pd1靶向對于il-2?vitokine的抗腫瘤有效性的重要性。這是通過比較p-0871(一種非靶向il-2?vitokine)與p-0831來完成的。p-0871和p-0831兩者共有相同的d2結構域和d3結構域以及l1接頭和l2接頭，但p-0871的d1結構域是非靶向種系抗體p-1260，含有具有seq?id?no:191、192和193的異源二聚體重鏈和輕鏈。以10mg/kg的劑量向攜帶皮下植入的ct26腫瘤的小鼠施用兩次q12d腹膜內注射媒介物(pbs)、p-0722、p-0831或p-0871。圖30描繪了每組的平均腫瘤體積(連同sem)隨時間的變化。結果顯示出，與其非靶向對應物p-0871相比，p-0831在延緩腫瘤生長方面明顯更有效。這表明靶向pd1對于增強p-0831的抗腫瘤效力至關重要。總之，這些發現強烈表明pd1?ab-il-2?vitokine的抗腫瘤作用取決于體內蛋白水解裂解過程，其隨后導致il-2的活化。此外，這種vitokine的有效性表現為與其靶向pd1的能力密切相關，表明pd1靶向在其治療潛力中起著重要作用。實施例18pd1?ab-il-2免疫細胞因子的構建和離體表征將il-2變體與pd1抗體拴系旨在將il-2變體優先順式遞送至pd1+細胞，諸如腫瘤微環境中活化和耗盡的cd8+t細胞，促進選擇性信號傳導。該策略還減少了il-2的全身暴露，并且可以通過去除負調節和在功能和數量兩方面重振t細胞來提供協同作用。除了vitokine平臺之外，使用與il-2rα結合降低/消除的且il-2rβγ活性減弱的il-2變體提供了一種替代方法來平衡細胞因子和抗體臂之間的比例，所述細胞因子和抗體臂在它們的天然形式中表現出顯著不同的效力和分子量。這種平衡允許最佳劑量并保留每個臂的功能。預期減少的細胞因子活性將使外周活化最小化，減輕體內抗原沉沒和靶介導的沉積，并促進經由抗體臂的腫瘤靶向。用于構建pd1?ab-il-2免疫細胞因子的pd1抗體選自包含seq?id?no:44中列出的輕鏈序列和seq?id?no:45-49中列出的重鏈序列的優化的人類pd1阻斷抗體。這些優化的pd1阻斷抗體對人類pd1蛋白具有高親和力，并且在阻斷pd1方面表現出與帕博利珠單抗相等或相當的效力。它們還具有更高的與其最接近的人類種系序列的序列相似性評分，導致與帕博利珠單抗相比提高的人源性程度。此外，預測它們具有較低的疏水性，這繼而可能比帕博利珠單抗降低它們的聚集傾向。預計使用這些優化的pd1阻斷抗體構建的pd1靶向性il-2免疫細胞因子也具有增強的可開發性譜。當產生pd1?ab單體il-2免疫細胞因子融合體時，il-2變體經由肽接頭融合至pd1抗體的含knob異源二聚體重鏈的c末端。人類igg1?knob-into-hole重鏈對還包含l234a、l235a、g237a突變以消除與fcγr和c1q的結合，但保留fcrn結合以用于藥代動力學(pk)。pd1ab-il-2免疫細胞因子的結構描繪于圖3b中，并且示例性免疫細胞因子列于表24中。表24示例性人類pd1?ab-il-2免疫細胞因子如本領域技術人員可以理解的，本發明中公開的任何優化的pd1抗體，包括具有seq?id?no:44-49中列出序列的那些，可以用于構建pd1?ab-il-2免疫細胞因子，其在本發明的精神和范圍內。同樣，本發明中公開的具有不同程度效力降低的任何il-2變體，尤其是具有seq?id?no:151-180中列出序列的那些，可以用作構建pd1靶向性il-2免疫細胞因子的構建模塊(building?block)。這些設計旨在加強和/或增強對于一系列癌癥的基于pd1抗體的療法。對所有基因進行密碼子優化以便在哺乳動物細胞中表達，通過genscript的服務亞合成并隨后克隆到接受者哺乳動物表達載體中。按照制造商的說明，通過與所述表達載體共轉染expicho細胞(thermofisher)來產生構建體。按照實施例2中詳述的相同程序進行蛋白質純化和表征。如預期的，最初以fc融合體形式觀察到的這些il-2變體的效力在與pd1抗體整合時被忠實地保留，如在測量ki67表達的人類pbmc測定中所顯示的。此外，表24中列出的這些示例性免疫細胞因子保持了其組分pd1抗體p-1271(seq?id?no:49和44)的結合和pd1阻斷活性，如在promega?pd1/pd-l1阻斷報告物測定中所證實的。類似地產生小鼠pd1?ab-il-2免疫細胞因子，以用于免疫活性的小鼠中的體內腫瘤模型。經由gs接頭(seq?id?no:114)將il-2變體融合至異源二聚體重鏈對(seq?id?no:189和190)的抗小鼠pd1?hc鏈2(seq?id?no:190)的c末端。小鼠pd1抗體的輕鏈具有seq?idno:52中列出的序列。示例性小鼠pd1?ab?il-2免疫細胞因子，特別是p-0782、p-0786和p-0783，特征在于分別具有p65r/c125i突變(seq?id?no:118)、l19q/p65r/c125i突變(seq?idno:152)和l19h/p65r/c125i突變(seq?id?no:151)的il-2變體。含有seq?id?no:117的il-2結構域的p-0837用作野生型il-2免疫細胞因子對照。隨后使用人類pbmc評估p-0782、p-0786和p-0783刺激cd8+t細胞和nk細胞中ki67表達的活性。如圖18a和圖18b中所圖示，由l19突變的摻入導致的p-0786和p-0783與p-0782相比的效力減弱程度(示出于圖31a和圖31b中)與其各自的fc融合體對應物p-0759和p-0731與p-0704并行。使用ctll-2細胞進一步評估p-0782、p-0786和p-0783的增殖活性，所述ctll-2細胞是來源于c57bl/6小鼠的細胞毒性t細胞。簡言之，收獲ctll2細胞，洗滌并重懸于不含il-2的培養基(rpmi1640、10％?fcs、2mm谷氨酰胺)中饑餓2小時時間段。饑餓后，將這些細胞以50,000個/ml轉移到96孔u底板中。然后加入pd1?ab-il-2免疫細胞因子的系列稀釋液，隨后為兩天的孵育。根據制造商的說明，使用celltiter-glo(promega)并測量發光信號來評估細胞增殖。如圖31c中描繪，當與p-0782相比時，由p-0786中的l19q和p-0783中的l19h突變引起的效力降低在小鼠來源的細胞和人類原代細胞之間是一致的。這種一致性突出了小鼠作為分析il-2效力變化對體內藥效學和抗腫瘤功效的影響的可靠模型。實施例19pd1?ab?il-2免疫細胞因子在小鼠中的藥效學作用使用單一劑量施用在c57bl/6小鼠中評估小鼠pd1?ab-il-2免疫細胞因子的藥效學作用。在開始研究之前，允許來自charles?river實驗室的7周齡雌性c57bl/6小鼠有7天的適應時間段。在第0天，給予小鼠腹膜內注射媒介物或以下測試化合物之一：p-0837、p-0782、p-0783或p-0786。注射后第0天、第3天、第5天和第10天抽取血液樣品。每組由5只小鼠組成。按照實施例14中概述的程序進行肝素處理的全血的免疫譜分析。在以2mg/kg單次注射后，在測試化合物之間觀察到cd8細胞和nk細胞擴增的顯著差異。含有消除il-2rα結合但不影響il-2rβγ相互作用的突變的p-0782表現出cd8+t細胞(圖32a)和nk細胞(圖32b)的劇烈擴增。這些淋巴細胞亞群的擴增在第3天開始，在第7天達到峰值，cd8+t細胞增加68倍，并且nk細胞顯著增加182倍。形成鮮明對比的是，充當野生型對照的p-0837展示出溫和得多的響應。兩種淋巴細胞兩者的細胞擴增峰值出現在第5天，更適中的cd8+t細胞增加3.9倍，并且nk細胞增加6.8倍，如圖32a和圖32b所圖示。消除il-2rα結合的突變可以使il-2rα(cd25)沉沒作用最小化，隨后增加il-2rβγ的可用性。如p-0782(一種il-2rβγ選擇性全激動劑)中示出，這種富集的受體接合引發細胞毒性細胞的劇烈擴增。假設il-2突變設計為減少但不消除il-2rα結合可以微調調節性t細胞的應答(如圖15b中所圖示)。適量調節il-2rα結合可以建立免疫平衡，以改善全身耐受性，而不損害腫瘤殺傷功效。圖32a和圖32b還展示了p-0783和p-0786在2mg/kg劑量后的藥效學。與p-0782相比，p-0786和p-0783觀察到的最大響應顯著降低，與它們總體減弱的效力一致。然而，與p-0837相反，p-0786對細胞擴增表現出顯著延長和增強的劑量響應效應。cd8+t細胞和nk細胞兩者數量的增加都經歷了延遲，但是持續和持久的。在第7天觀察到峰值響應，展示出cd8+t細胞8.6倍增加和nk細胞13倍增加。這些數量到第10天沒有回到基線水平。包含甚至更弱的il-2激動劑的p-0783顯示出類似的延遲但持久的作用，以劑量依賴性方式導致cd8+t細胞5.5倍的擴增和nk細胞14倍的擴增(圖32a和圖32b)。另外，圖32c突出了在小鼠中的效力水平、細胞毒性淋巴細胞的擴增和所得體重減輕之間的直接相關性。具體地，p-0782是il-2rβγ選擇性全激動劑，誘導cd8+t細胞和nk細胞兩者的數量急劇增加，導致測試化合物中最顯著的體重減輕。效力減弱的激動劑p-0786和p-0783顯示出增強的體內耐受性。其中，p-0783表現為比p-0786稍微更耐受，與其作為兩者中較弱激動劑的表征一致。總之，p-0782通過顯著促進cd8+t細胞和nk細胞的增殖和擴增，顯示了穩健的藥效學作用。雖然p-0786和p-0783展示出較弱的作用，但它們的響應是持續的。這些化合物的體外和體內效力評估通常一致。值得注意的是，與全效p-0782相比，p-0786和p-0783的減弱效力導致體內耐受性改善。這些發現支持了我們的設計前提，即削弱細胞因子效力有助于緩解途徑過度活化和減輕抗原沉沒和靶介導的沉積，最終降低毒性并改善藥代動力學和藥效學結果。實施例20pd1?ab?il-2免疫細胞因子在同基因小鼠腫瘤模型中的體內功效在mc38鼠結腸癌模型中研究pd1?ab-il-2免疫細胞因子(包括p-0837、p-0782、p-0783和p-0786)的抗腫瘤功效。將7-9周齡的雌性c57bl/6小鼠皮下植入mc38細胞。一旦腫瘤體積在約2周后平均～75mm3，將小鼠隨機化(n＝8)，并且每12天(q12d)用0.5mg/kg的免疫細胞因子2次注射處理。媒介物(pbs)包括在內作為對照。每周兩次監測腫瘤尺寸和小鼠體重。如果腫瘤達到/超過1500mm3或變為壞死，則對動物實施安樂死。在圖33a中，呈現了每組的平均腫瘤體積以及平均值的標準誤差(sem)隨時間的變化。媒介物組(pbs處理)顯示出快速腫瘤生長。p-0837(一種具有野生型il-2等同物的pd1ab免疫細胞因子)與媒介物組相比僅抑制了37％的腫瘤生長。然而，其他pd1?ab-il-2免疫細胞因子p-0782、p-0783和p-0786均在處理后到26天顯著降低85％-90％腫瘤生長。在第26天對個體腫瘤體積(由每個點表示)的進一步分析(圖33b)揭示，盡管腫瘤生長抑制相似，但p-0782僅使兩只小鼠無腫瘤，而p-0783和p-0786各有五個無腫瘤情況。后兩者都具有減弱的il-2效力。假設完全il-2激動劑p-0782可能導致途徑過度活化、靶介導的沉積、活化誘導的細胞死亡和t細胞上抑制信號的上調，最終導致體內抗腫瘤效力降低。因此，只有具有減弱il-2的pd1?ab-il-2免疫細胞因子將被進一步研究用于體內抗腫瘤功效。在圖34圖示的類似進行的實驗中，p-0783和p-0786兩者在0.3mg/kg的低劑量(兩個q10d劑量)均顯示出顯著的腫瘤生長抑制。在第41天，即第二次且最后一次處理后30天，用p-0783處理的8只小鼠中的5只和用p-0786處理的8只小鼠中的6只沒有腫瘤生長。在該劑量，p-0786與p-0783相比表現出稍微更好的抗腫瘤作用。圖35a和圖35b展示了用兩個q10d劑量的p-0782或小鼠pd1抗體p-0722處理的小鼠中腫瘤體積和體重變化隨時間的進展。在9mg/kg的劑量，p-0722顯示出極小的功效。形成鮮明對比的是，即使將p-0786的劑量降低至1/9(1mg/kg)，也觀察到顯著且延長的抗腫瘤響應。到第45天，即最后的處理后34天，所有用p-0786處理的小鼠均未顯示出腫瘤生長。此外，用1mg/kg的p-0786未觀察到顯著的體重降低(圖35b)。這些發現突出了il-2組分在增強pd1ab-il-2免疫細胞因子的抗腫瘤有效性中的關鍵作用。此外，評價了p-0786對mc38腫瘤生長抑制的劑量響應。具有已建立的mc38腫瘤(平均腫瘤體積為～75mm3且n＝8)的小鼠腹膜內接受0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg和1mg/kg的兩個q14d劑量的p-0786。圖36a展示了每組的平均腫瘤體積±sem隨時間的變化，并且圖36b至圖36e圖示出了每個劑量組的個體腫瘤生長曲線。展示了媒介物組的平均腫瘤尺寸±sem(由虛線表示)用于比較。0.03mg/kg和0.1mg/kg兩個劑量均導致適中的36％?tgi，到第21天沒有小鼠表現出完全的腫瘤消退。然而，當劑量以大約3倍的增量從0.1mg/kg增加到1mg/kg時，出現了明顯的劑量響應。在0.3mg/kg，在第21天達到81％?tgi，其中8只小鼠中有2只無腫瘤。令人印象深刻的是，在1mg/kg劑量，所有8只小鼠均顯示出完全腫瘤根除。未顯示出腫瘤生長的10只小鼠(2只來自0.3mg/kg劑量，并且8只來自1mg/kg劑量)在初始植入后第109天或首次p-0786劑量后94天進行mc38細胞的再攻擊植入。圖37揭示了這些被再攻擊的小鼠都沒有腫瘤復發，不同于用作對照的成功地發展了腫瘤的年齡匹配的初始小鼠。這些發現表明pd1?ab?il-2免疫細胞因子成功誘導了長期免疫。還在以下兩種其他同基因腫瘤模型中評價了p-0786的功效：鼠ct26結腸癌和b16f10鼠黑素瘤模型。在ct26模型中，雌性balb/c小鼠被皮下植入5×105個ct26細胞，而b16f10模型類似地通過將5x?105個b16f10細胞植入雌性c57bl/6小鼠中來建立。荷ct26瘤小鼠每12天接受兩個劑量的p-0786(0.6mg/kg和2mg/kg)，而荷b16f10瘤小鼠每10天接受相同的劑量。用每周兩次的腫瘤測量常規監測所有小鼠。圖38揭示了p-0786在ct26模型(圖38a)和b16f10模型(圖38b)兩者中的劑量依賴性單一劑抗腫瘤作用。在ct26模型中，兩種劑量均有強的腫瘤生長抑制(到第21天，在0.6mg/kg為65％?tgi，在2mg/kg為91％?tgi)。到第一次處理后第41天，0.6mg/kg組中的7只小鼠中有1只無腫瘤，并且2mg/kg組中的7只小鼠中有2只無腫瘤。與mc38模型相比，b16f10模型侵襲性地生長并且對pd1療法的響應較低，顯示出p-0786的初始腫瘤生長延遲(在0.6mg/kg為35％?tgi，在2mg/kg為58％?tgi)，但腫瘤最終在所有小鼠中發展(圖38b)。總之，pd1?ab-il-2免疫細胞因子在跨多于一個同基因小鼠腫瘤模型中有效地抑制腫瘤生長。當與il-2rβγ選擇性全激動劑相比時，通過破壞il-2rβ相互作用實現的效力減弱的il-2，顯示了改善的體內耐受性和增強的單一劑抗腫瘤功效。預測以干擾γc相互作用的il-2突變為特征的pd1?ab?il-2免疫細胞因子將具有類似的改善。鑒于γc在外周細胞中的不同表達譜，具有減弱的γc活性的il-2變體可能提供減少靶沉沒和增強生物可利用度的附加益處。本文公開的和要求保護的所有物品和方法鑒于本公開內容均可被制備和執行而無需過度實驗。盡管已根據優選的實施方案描述本發明的物品和方法，但對于本領域技術人員將明顯的是，變化形式可被應用到所述物品和方法而不偏離本發明的精神和范圍。對于本領域技術人員明顯的是，所有這樣的變化和等效物，無論是現有的還是以后開發的，都被認為是在由所附權利要求書限定的本發明的精神和范圍之內。本說明書中提及的所有專利、專利申請和出版物指示本發明所屬領域的普通技術人員的水平。為了所有目的，所有專利、專利申請和出版物通過引用以其整體并入本文，并且其程度如同每個單獨出版物單獨地且具體地被指示為了任何和所有目的通過引用以其整體并入本文。本文示例性地描述的發明可在本文未具體地公開的任何一個或更多個要素不存在的情況下被合適地實踐。因此，應理解，盡管本發明已通過優選的實施方案和任選的特征被具體地公開，但是本領域技術人員可尋求本文公開的概念的改變和變化形式，并且認為此類改變和變化形式在由所附的權利要求書限定的本發明的范圍內。序列表在所附的序列表中列出的氨基酸序列按37c.f.r.1.822中規定的使用核苷酸堿基的標準字母縮寫和氨基酸的單字母編碼示出。seq?id?no:1是成熟人類pd1多肽的氨基酸序列。seq?id?no:2-5是人類pd1阻斷抗體輕鏈可變結構域的氨基酸序列。seq?id?no:6-18是人類pd1阻斷抗體重鏈可變結構域的氨基酸序列。seq?id?no:19-21是人類pd1阻斷抗體輕鏈cdr1的氨基酸序列。seq?id?no:22-24是人類pd1阻斷抗體輕鏈cdr2的氨基酸序列。seq?id?no:25是人類pd1阻斷抗體輕鏈cdr3的氨基酸序列。seq?id?no:26是人類pd1阻斷抗體重鏈cdr1的氨基酸序列。seq?id?no:27-32是人類pd1阻斷抗體重鏈cdr2的氨基酸序列。seq?id?no:33是人類pd1阻斷抗體重鏈cdr3的氨基酸序列。seq?id?no:34是人類κ輕鏈恒定結構域的氨基酸序列。seq?id?no:35是包含l234a/l235a/g237a突變的人類igg1重鏈恒定結構域的氨基酸序列。seq?id?no:36是包含s228p突變的人類igg4重鏈恒定結構域的氨基酸序列。seq?id?no:37是人類免疫球蛋白種系外顯子hghv1-2的氨基酸序列(genbank登錄號：x62106)。seq?id?no:38是人類免疫球蛋白種系外顯子hghv3-23的氨基酸序列(genbank登錄號：m99660)。seq?id?no:39是人類免疫球蛋白種系外顯子hgkv3d-11的氨基酸序列(genbank登錄號：x17264)。seq?id?no:40是人類抗體重鏈可變結構域的氨基酸序列，genbank登錄號為：ab063829。seq?id?no:41是人類抗體輕鏈可變結構域的氨基酸序列，genbank登錄號為：m29469。seq?id?no:42是參考人類pd1阻斷抗體p-0734的輕鏈的氨基酸序列。seq?id?no:43是參考人類pd1阻斷抗體p-0734的重鏈的氨基酸序列。seq?id?no:44是人類pd1阻斷抗體的輕鏈的氨基酸序列。seq?id?no:45是人類pd1阻斷抗體p-1174的重鏈的氨基酸序列。seq?id?no:46是人類pd1阻斷抗體p-1194的重鏈的氨基酸序列。seq?id?no:47是人類pd1阻斷抗體p-1201的重鏈的氨基酸序列。seq?id?no:48是人類pd1阻斷抗體p-1238的重鏈的氨基酸序列。seq?id?no:49是pd1人類阻斷抗體p-1271的重鏈的氨基酸序列。seq?id?no:50是基準人類pd1阻斷抗體p-0795的輕鏈的氨基酸序列。seq?id?no:51是基準人類pd1阻斷抗體p-0795的重鏈的氨基酸序列。seq?id?no:52是替代物小鼠pd1阻斷抗體p-0722的輕鏈的氨基酸序列。seq?id?no:53是替代物小鼠pd1阻斷抗體p-0722的重鏈的氨基酸序列。seq?id?no:54-77是各種蛋白酶底物肽的氨基酸序列。seq?id?no:78-94是包含側翼于蛋白酶底物肽的各種間隔物肽的各種蛋白酶可裂解接頭的氨基酸序列。seq?id?no:95-115是各種不可裂解的接頭序列的氨基酸序列。seq?id?no:116是人類il-2成熟形式氨基酸序列。seq?id?no:117-180是人類il-2變體多肽的氨基酸序列。seq?id?no:181是人類il-2rα氨基酸序列。seq?id?no:182是人類il-2rαsushi結構域氨基酸序列。seq?id?no:183-185是人類il-2rαsushi結構域變體多肽的氨基酸序列。seq?id?no:186是包含l234a/l235a/g237a突變的人類igg1?fc的氨基酸序列。seq?id?no:187是包含l234a/l235a/g237a突變的人類igg1?knob-fc的氨基酸序列。seq?id?no:188是包含l234a/l235a/g237a突變的人類igg1?hole-fc的氨基酸序列。seq?id?no:189和190是替代物小鼠pd1?ab?p-0722的異源二聚體重鏈的氨基酸序列。seq?id?no:191和192是種系抗體p-1260的異源二聚體重鏈的氨基酸序列。seq?id?no:193是種系抗體p-1260的輕鏈的氨基酸序列。seq?id?no:194-209是各種人類pd1?ab和/或人類pd1?ab-il-2?vitokine的重鏈的氨基酸序列。seq?id?no:210-215是各種人類pd1?ab-il-2免疫細胞因子的重鏈的氨基酸序列。序列表人類pd1成熟蛋白序列fldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvvgvvggllgslvllvwvlavicsraargtigarrtgqplkedpsavpvfsvdygeldfqwrektpeppvpcvpeqteyativfpsgmgtssparrgsadgprsaqplrpedghcswpl(seq?id?no:1)人類pd1阻斷抗體輕鏈可變結構域序列eivltqspatlslspgeratlscraskgvstsgysylhwyqqkpgqaprlliylasylesgvparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfgggtkveikr(seq?id?no:2)人類pd1阻斷抗體輕鏈可變結構域序列eivltqspatlslspgeratlscrasqgvstsgysylhwyqqkpgqaprlliylasyresgvparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfgggtkveikr(seq?id?no:3)人類pd1阻斷抗體輕鏈可變結構域序列eivltqspatlslspgeratlscrasqgvstsgysylhwyqqkpgqaprlliylasyrasgvparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfgggtkveikr(seq?id?no:4)人類pd1阻斷抗體輕鏈可變結構域序列eivltqspatlslspgeratlscrasqgvstsgysylawyqqkpgqaprlliylasyrasgvparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfgggtkveikr(seq?id?no:5)人類pd1阻斷抗體重鏈可變結構域序列qvqlvqsgvevkkpgasvkvsckasgytftnyymywvrqapgqglewmgginpsnggtnfnekfknrvtlttdsstttaymelkslqfddtavyycarrdyrfdmgfdywgqgttvtvss(seq?id?no:6)人類pd1阻斷抗體重鏈可變結構域序列qvqlvqsgvevkkpgasvkvsckasgytftnyymywvrqapgqglewmgginpsnggtnfaqkfqgrvtlttdsstttaymelkslqfddtavyycarrdyrfdmgfdywgqgttvtvss(seq?id?no:7)人類pd1阻斷抗體重鏈可變結構域序列qvqlvqsgvevkkpgasvkvsckasgytftnyymywvrqapgqglewmgginpsnggtnyaqk?fqgrvtlttdsstttaymelkslqfddtavyycarrdyrfdmgfdywgqgttvtvss(seq?id?no:8)人類pd1阻斷抗體重鏈可變結構域序列qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftnyymywvrqapgqglewmgginpsnggtnfaqkf?qgrvtlttdsststaymelsslrsddtavyycarrdyrfdmgfdywgqgtlvtvss(seq?id?no:9)人類pd1阻斷抗體重鏈可變結構域序列evqllesggglvqpggslrlscaasgftftnyymywvrqapgkglewvsginpsnggtnyadkfk?grftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarrdyrfdmgfdywgqgtlvtvss(seq?id?no:10)人類pd1阻斷抗體重鏈可變結構域序列evqllesggglvqpggslrlscaasgftftnyymywvrqapgkglewvsginpsnggtnyadkfk?grftlstdsskntlylqmnslraedtavyycarrdyrfdmgfdywgqgtlvtvss(seq?id?no:11)人類pd1阻斷抗體重鏈可變結構域序列evqllesggglvqpggslrlscaasgftftnyymywvrqapgkglewmgginpsnggtnyadkfk?grftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarrdyrfdmgfdywgqgtlvtvss(seq?id?no:12)人類pd1阻斷抗體重鏈可變結構域序列evqllesggglvqpggslrlscaasgftftnyymywvrqapgkglewmgginpsnggtnyadkfk?grftlstdsskntlylqmnslraedtavyycarrdyrfdmgfdywgqgtlvtvss(seq?id?no:13)人類pd1阻斷抗體重鏈可變結構域序列evqllesggglvqpggslrlscaasgftftnyymywvrqapgkglewvsginpsnggtnfndsvk?grftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarrdyrfdmgfdywgqgtlvtvss(seq?id?no:14)人類pd1阻斷抗體重鏈可變結構域序列evqllesggglvqpggslrlscaasgftftnyymywvrqapgkglewvsginpsnggtnfadkfk?grftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarrdyrfdmgfdywgqgtlvtvss(seq?id?no:15)人類pd1阻斷抗體重鏈可變結構域序列evqllesggglvqpggslrlscaasgftftnyymywvrqapgkglewvsginpsnggtnfadkfk?grftisrdsskntlylqmnslraedtavyycarrdyrfdmgfdywgqgtlvtvss(seq?id?no:16)人類pd1阻斷抗體重鏈可變結構域序列evqllesggglvqpggslrlscaasgftftnyymywvrqapgkglewvsginpsnggtnfadkfk?grftistdsskntlylqmnslraedtavyycarrdyrfdmgfdywgqgtlvtvss(seq?id?no:17)人類pd1阻斷抗體重鏈可變結構域序列evqllesggglvqpggslrlscaasgftftnyymywvrqapgkglewvsginpsnggtnfadkfk?grftlstdsskntlylqmnslraedtavyycarrdyrfdmgfdywgqgtlvtvss(seq?id?no:18)人類pd1阻斷抗體cdr-l1序列raskgvstsgysylh(seq?id?no:19)人類pd1阻斷抗體cdr-l1序列rasqgvstsgysylh(seq?id?no:20)人類pd1阻斷抗體cdr-l1序列rasqgvstsgysyla(seq?id?no:21)人類pd1阻斷抗體cdr-l2序列ylasyles(seq?id?no:22)人類pd1阻斷抗體cdr-l2序列ylasyres(seq?id?no:23)人類pd1阻斷抗體cdr-l2序列ylasyras(seq?id?no:24)人類pd1阻斷抗體cdr-l3序列qhsrdlplt(seq?id?no:25)人類pd1阻斷抗體cdr-h1序列nyymy(seq?id?no:26)人類pd1阻斷抗體cdr-h2序列ginpsnggtnfnekfkn(seq?id?no:27)人類pd1阻斷抗體cdr-h2序列ginpsnggtnfaqkfqg(seq?id?no:28)人類pd1阻斷抗體cdr-h2序列ginpsnggtnyaqkfqg(seq?id?no:29)人類pd1阻斷抗體cdr-h2序列ginpsnggtnyadkfkg(seq?id?no:30)人類pd1阻斷抗體cdr-h2序列ginpsnggtnfadkfkg(seq?id?no:31)人類pd1阻斷抗體cdr-h2序列ginpsnggtnfndsvkg(seq?id?no:32)人類pd1阻斷抗體cdr-h3序列rdyrfdmgfdy(seq?id?no:33)人類κ輕鏈恒定結構域序列tvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq?id?no:34)具有l234a/l235a/g237a突變序列的人類igg1恒定結構域astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq?id?no:35)具有s228p突變序列的人類igg4恒定結構域astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslg(seq?id?no:36)人類抗體種系ighv1-2序列qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyymhwvrqapgqglewmgwinpnsggtnyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycar(seq?id?no:37)人類抗體種系ighv3-23序列evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsaisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycak(seq?id?no:38)人類抗體種系igkv3d-11序列eivltqspatlslspgeratlscrasqgvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgpgtdftltisslepedfavyycqqrsnwh(seq?id?no:39)人類抗體genbank?no: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背景技術：
技術實現思路