本公開的實施方案涉及制備用于測序或其他應用的核酸。具體而言，本文提供的蛋白質、方法、組合物和試劑盒的實施方案涉及通過使用測序文庫和其他方法進行的甲基化狀態的標測。

背景技術：

1、經修飾的dna胞嘧啶，包括5-甲基胞嘧啶(5mc)和5-羥甲基胞嘧啶(5hmc)，是深入研究的表觀遺傳修飾，它在人類發育和疾病中發揮基本作用。它的全基因組分布在組織類型之間以及在健康狀態和疾病狀態之間是不同的。近年來，5mc作為臨床診斷工具也受到關注：它在從液體活檢樣品獲得的無細胞dna(cfdna)中的分布可用于早期癌癥的組織特異性預測或者治療后癌癥復發或緩解的監測。因此，在樣品dna數量、質量和復雜性損失最小的情況下，以單堿基分辨率對經修飾的dna胞嘧啶進行標測的方法的開發已得到密切關注。然而，目前用于對經修飾的dna胞嘧啶進行標測的方法顯示出局限性，這些局限性包括(i)由于在非中性ph和高溫處進行的長期化學處理而導致樣品dna降解，(ii)由于未甲基化的dna堿基轉化為尿嘧啶而導致樣品dna復雜性喪失，從而產生低復雜性基因組標測，(iii)多步轉化同時需要酶和化學處理，以及(iv)對于基于抗體的5mc檢測，檢測的分辨率被限制于約150bp，這妨礙了其在基因組中的確切位置的鑒定。

2、5-羥甲基胞嘧啶(5hmc)是廣泛研究的表觀遺傳修飾5-甲基胞嘧啶(5mc)的氧化衍生物。越來越多的證據支持5hmc在哺乳動物的多種發育過程(諸如神經發生)中的生物學重要性。因此，確定5hmc在來自健康和患病患者的dna中的定位受到廣泛關注。對5-羥甲基胞嘧啶(5hmc)進行標測的大多數方法需要亞硫酸氫鹽處理，這會導致顯著的dna喪失和損傷。最近開發了用于對5hmc進行標測的方法，諸如oxbs-seq、tab-seq和ace-seq，但是一些方法包括亞硫酸氫鹽處理，并且均涉及使用不同的酶的多個步驟。

技術實現思路

1、本公開提供了用于使用物理上緊密接近的胞苷脫氨酶和解旋酶確定dna和rna的甲基化狀態的蛋白質、方法、組合物和試劑盒。與目前用于對胞嘧啶(c)核苷酸的甲基化狀態進行標測的方法不同的是，本公開提供了使用經改變的胞苷脫氨酶進行的一步完全酶促方法，所述經改變的胞苷脫氨酶選擇性地作用于靶核酸的某些經修飾的胞嘧啶，并且將它們轉化為胸苷(t)或經修飾的胸苷類似物。本文所述的經改變的胞苷脫氨酶避開了目前可用的對甲基化的胞嘧啶核苷酸進行標測的方法的限制，因為(i)它們在近中性ph和生理溫度處具有活性，(ii)未甲基化的胞嘧啶以降低的速率發生反應，因此樣品dna復雜性得以保持，(iii)甲基化的c至t的轉化是一步酶促反應，(iv)方法使得以單堿基分辨率檢測甲基化的c，以及(v)方法維持dna復雜性，從而簡化了通過下一代測序進行的分析。本文所述的經改變的和野生型(wt)胞苷脫氨酶通常對單鏈核酸具有更高的催化活性。在核酸處理期間，使用物理上緊密接近的解旋酶和胞苷脫氨酶預期證明對雙鏈核酸的改善的催化活性。

2、本公開還提供了用于對dna和rna中存在的5-羥甲基胞嘧啶(5hmc)核苷酸進行標測的蛋白質、方法、組合物和試劑盒。目前用于對5hmc核苷酸的甲基化狀態進行標測的方法包括修飾或阻斷5hmc核苷酸的步驟。例如，ace-seq方法(schutsky等人，naturebiotechnology，10.1038/nbt.4204.2018年10月8日，doi：10.1038/nbt.4204)通過使用β-葡萄糖基轉移酶(βgt)進行的向5ghmc的轉化來阻斷5hmc。與目前用于對5hmc核苷酸的甲基化狀態進行標測的方法不同的是，本文提供的方法不需要修飾或阻斷5hmc核苷酸。相反，本公開提供了使用經改變的胞苷脫氨酶進行的一步完全酶促方法，所述經改變的胞苷脫氨酶選擇性地作用于靶核酸的某些經修飾的胞嘧啶，并且將它們轉化為尿嘧啶(u)或胸苷(t)，但是不作用于5hmc、5-甲酰基胞嘧啶(5fc)或5-羧基胞嘧啶(5-cac)。本文所述的經改變的胞苷脫氨酶避開了目前可用的對5hmc核苷酸進行標測的方法的限制，因為(i)不需要導致dna和rna大量損失的苛刻化學處理，(ii)轉化是一步酶促反應，以及(iii)方法使得以單堿基分辨率檢測5hmc。

3、本公開內容包括經改變的胞苷脫氨酶，包括經改變的胞苷脫氨酶和第二蛋白(諸如解旋酶)的蛋白復合物。在一個實施方案中，經改變的胞苷脫氨酶包含在功能上等同于野生型apobec3a蛋白中的(tyr/phe)130和tyr132的位置處的氨基酸取代突變。在另一個實施方案中，經改變的胞苷脫氨酶包含在功能上等同于野生型apobec3a蛋白中的(tyr/phe)130的位置處的氨基酸取代突變，其中所述取代突變是(tyr/phe)130trp。經改變的胞苷脫氨酶的(tyr/phe)130可以是tyr130，并且所述野生型apobec3a蛋白是seq?id?no：3。本公開還包括編碼經改變的胞苷脫氨酶的多核苷酸。

4、本公開還提供了包含本文所述的經改變的胞苷脫氨酶的組合物，包括胞苷脫氨酶和第二蛋白(諸如解旋酶)的蛋白復合物。在一個實施方案中，組合物可另外包含以下中的至少一者：(i)包含dna的樣品，所述dna包含至少一個經修飾的胞嘧啶，其中所述經修飾的胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶(5mc)、5-羥甲基胞嘧啶(5hmc)、5-甲酰基胞嘧啶(5fc)、5-羧基胞嘧啶(5cac)或它們的組合；或(ii)緩沖液，諸如ph低于7的緩沖液；或者(iii)它們的組合。

5、本公開還提供了使用本文所述的胞苷脫氨酶的方法，所述胞苷脫氨酶包括經改變的胞苷脫氨酶和第二蛋白(諸如解旋酶)的蛋白復合物。在一個實施方案中，一種方法包括提供懷疑包含單鏈dna的dna樣品，所述單鏈dna包含至少一個5-甲基胞嘧啶(5mc)、至少一個5-羥甲基胞嘧啶(5hmc)、至少一個5-甲酰基胞嘧啶(5fc)、至少一個5-羧基胞嘧啶(5cac)或它們的組合；使所述單鏈dna與經改變的胞苷脫氨酶在適于(i)通過脫氨使5-甲基胞嘧啶(5mc)轉化為胸苷(t)的速率大于通過脫氨使胞嘧啶(c)轉化為尿嘧啶(u)的速率的條件下進行接觸，以產生轉化的單鏈dna，或者在適于(ii)通過脫氨使c轉化為u以及通過脫氨使5mc轉化為t的速率大于通過脫氨使5-羥甲基胞嘧啶(5hmc)轉化為5-羥甲基尿嘧啶(5hmu)的速率的條件下進行接觸；以及處理所述轉化的單鏈dna以產生測序文庫。

6、在另一個實施方案中，一種方法包括提供懷疑包含雙鏈dna的dna樣品，所述雙鏈dna包含至少一個5-甲基胞嘧啶(5mc)、至少一個5-羥甲基胞嘧啶(5hmc)、至少一個5-甲酰基胞嘧啶(5fc)、至少一個5-羧基胞嘧啶(5cac)或它們的組合；處理所述雙鏈dna以產生測序文庫；使所述測序文庫變性以產生單鏈dna；使所述單鏈dna與經改變的胞苷脫氨酶在適于(i)通過脫氨使5-甲基胞嘧啶(5mc)轉化為胸苷(t)的速率大于通過脫氨使胞嘧啶(c)轉化為尿嘧啶(u)的速率的條件下進行接觸，或者在適于(ii)通過脫氨使c轉化為u以及通過脫氨使5mc轉化為t的速率大于通過脫氨使5-羥甲基胞嘧啶(5hmc)轉化為5-羥甲基尿嘧啶(5hmu)的速率的條件下進行接觸，以產生轉化的單鏈dna；以及將所述轉化的單鏈dna轉化為轉化的雙鏈dna測序文庫。

7、在一個實施方案中，一種方法可包括檢測經修飾的胞嘧啶在靶核酸中的位置。所述方法可包括(a)使懷疑包含至少一個經修飾的胞嘧啶的靶核酸與根據權利要求1或權利要求2所述的經改變的胞苷脫氨酶接觸，以產生包含至少一個轉化的胞嘧啶的轉化的核酸；以及(b)檢測(a)的所述轉化的核酸中的所述至少一個轉化的胞嘧啶。所述檢測可包括對所述轉化的核酸進行測序或使核酸探針與所述轉化的核酸雜交。

8、在檢測包括對轉化的核酸進行測序的實施方案中，所述方法可另外包括(c)將轉化的核酸的序列與未經處理的參考序列進行比較，以確定所述靶核酸中的哪些胞嘧啶被修飾。

9、在檢測包括使轉化的核酸與核酸探針雜交的實施方案中，則所述方法可另外包括核酸探針可存在于分析物陣列上，并且所述方法可另外包括對所雜交的轉化的核酸進行測序。在另一個實施方案中，所述方法可另外包括擴增轉化的核酸，其中核酸探針包含用于擴增預定序列的兩個引物，其中所述引物與包含至少一個轉化的胞嘧啶的轉化的核酸的區域退火的親和力大于與其中至少一個胞嘧啶不是轉化的胞嘧啶的轉化的核酸的區域退火的親和力，并且其中所擴增的產物的存在指示所述靶核酸中具有經修飾的胞嘧啶。在另一個實施方案中，所述方法可另外包括通過基于crispr的系統來切割單鏈dna(ssdna)報告底物，其中所述ssdna報告底物包含熒光團和淬滅劑，其中熒光的存在指示所述靶核酸中具有經修飾的胞嘧啶。在另一個實施方案中，轉化的核酸可存在于固定的細胞中，其中核酸探針包含熒光標記的探針，并且其中核酸探針與包含至少一個轉化的胞嘧啶的轉化的核酸的預定序列退火的親和力大于與其中至少一個胞嘧啶不是轉化的胞嘧啶的轉化的核酸的區域退火的親和力，其中細胞相關熒光的存在指示所述靶核酸中具有經修飾的胞嘧啶。

10、在檢測經修飾的胞嘧啶在靶核酸中的位置的一個實施方案中，所述靶核酸可從受試者獲得，并且所述檢測可包括獲得轉化的核酸中胞嘧啶修飾的模式。在一些實施方案中，所述方法可另外包括將轉化的核酸中的胞嘧啶修飾的模式與參考核酸中的胞嘧啶修飾的模式進行比較。例如，所述受試者可以是患有疾病或病癥或者處于患有疾病或病癥的風險中的受試者，并且所述參考核酸可以來自正常受試者。在一個實施方案中，胞嘧啶修飾的模式順式連接至疾病或病癥相關的編碼區。例如，胞嘧啶修飾的模式順式連接至編碼區，其中所述參考核酸中的編碼區是具有轉錄活性的或不具有轉錄活性的。所述比較可另外包括確定所述轉化的核酸的胞嘧啶修飾的模式指示所述受試者中的所述編碼區具有轉錄活性還是不具有轉錄活性。所述編碼區的轉錄可與疾病或病癥相關。

11、在一方面，本公開描述了包含胞苷脫氨酶和解旋酶的蛋白復合物。胞苷脫氨酶可是野生型胞苷脫氨酶，或者它可是經改變的胞苷脫氨酶。在一些實施方案中，經改變的胞苷脫氨酶可在功能上等同于野生型apobec3a蛋白中的(tyr/phe)130的位置處具有氨基酸取代突變。

12、在另一方面，本公開描述了包含蛋白復合物和dna樣品的組合物，該蛋白復合物包含胞苷脫氨酶和解旋酶，該dna樣品包含含有至少一個5mc的雙鏈dna。

13、在另一方面，本公開描述了一種方法，該方法包括提供懷疑包含含有至少一個5mc的dsdna的dna樣品，在適于將5mc轉化為t的條件下使樣品與本文所述的蛋白復合物接觸以產生轉化的dsdna，其中將5mc轉化為t，以及處理轉化的dsdna。

14、在另一方面，本公開描述了包含用于將5mc轉化為t的路徑以及用于定向分離雙鏈核酸的路徑的蛋白復合物。

15、除非另外指明，否則本文所用的術語應理解為具有其在相關領域中的普通含義。下面列出本文所用的若干術語及其含義。

16、如本文所用，術語“生物體"和“受試者”可互換使用并且是指微生物(例如，原核或真核)、動物和植物。動物的示例為哺乳動物，諸如人。

17、如本文所用，術語“靶核酸”旨在作為本文所示的方法、組合物或試劑盒的上下文中的核酸的語義標識符，并不一定限制核酸的結構或功能，除非另有明確說明。除非另外指明，否則對核酸諸如靶核酸的提及包括單鏈核酸和雙鏈核酸兩者，以及dna和rna兩者。術語文庫是指在3′和5′末端含有已知的常見序列(諸如通用序列或銜接子)的靶核酸的集合。

18、如本文所用，術語“銜接子”及其派生詞(例如，通用銜接子)通常是指可附接到靶核酸的任何線性寡核苷酸。銜接子可以是單鏈或雙鏈dna，或者可包括雙鏈區域和單鏈區域兩者。銜接子可包含：通用序列，該通用序列與引物(例如，通用引物)的至少一部分基本上相同或基本上互補；索引(在本文中也稱為條形碼或標簽)，該索引用于幫助下游糾錯、識別或測序；和/或獨特分子標識符。在一些實施方案中，銜接子與存在于樣品中的任何靶序列的3′端或5′端基本上不互補。在一些實施方案中，合適的銜接子長度在約6至100個核苷酸、約12至60個核苷酸或約15至50個核苷酸的長度范圍內。例如，術語“接頭”和“銜接子”可互換使用。

19、如本文所用，當用于描述核苷酸序列時，術語“通用”是指兩個或更多個核酸分子共有的序列區域，其中這些分子也具有彼此不同的序列區域。存在于核酸集合的不同成員中的通用序列可用作例如后續步驟中的“著陸區”以退火核苷酸序列，該核苷酸序列可用作將另一核苷酸序列(諸如索引)添加到靶核酸的引物。存在于核酸集合的不同成員中的通用序列可允許使用通用捕獲核酸群體(例如，與通用序列(例如，通用捕獲序列)的一部分互補的捕獲寡核苷酸)來捕獲多種不同的核酸。通用捕獲序列的非限制性示例包括與p5和p7引物相同或互補的序列。類似地，存在于分子集合的不同成員中的通用序列可允許使用與通用序列(例如，通用錨定序列)的一部分互補的通用引物的群體來復制(例如，測序)或擴增多種不同的核酸。在一個實施方案中，通用錨定序列用作通用引物(例如，用于讀段1或讀段2的測序引物)退火至其進行測序的位點。因此，捕獲寡核苷酸或通用引物包含可與通用序列特異性雜交的序列。

20、當涉及通用捕獲序列或捕獲寡核苷酸時，可使用術語“p5”和“p7”。術語“p5′”(p5上撇號)和“p7′”(p7上撇號)分別是指p5和p7的互補序列。應當理解，任何合適的通用捕獲序列或捕獲寡核苷酸都可用于本文所呈現的方法中，并且p5和p7的使用僅為示例性實施方案。在流通池上使用捕獲寡核苷酸諸如p5和p7或其互補序列是本領域已知的，如wo?2007/010251、wo?2006/064199、wo?2005/065814、wo?2015/106941、wo?1998/044151和wo?2000/018957的公開內容所例示，這些專利中關于p5和p7以及它們的使用的內容以引用的方式并入。例如，任何合適的正向擴增引物，無論是固定化的還是處于溶液狀態的，都可用于本文所呈現的方法中，以用于與互補序列雜交和擴增序列。類似地，任何合適的反向擴增引物，無論是固定化的還是處于溶液狀態的，都可用于本文所呈現的方法中，以用于與互補序列雜交和擴增序列。本領域的技術人員將理解如何設計和使用適用于捕獲和/或擴增本文所呈現的核酸的引物序列。

21、如本文所用，術語“引物”及其派生詞通常是指可與所關注靶序列雜交的任何核酸。通常，引物用作基板，核苷酸可通過聚合酶聚合到該基板上或多核苷酸可連接到該基板；然而，在一些實施方案中，引物可摻入合成的核酸鏈中并提供另一引物可與之雜交的位點，以引發與合成的核酸分子互補的新鏈的合成。在一些實施方案中，引物可用于與預定序列雜交，例如包括鑒定經修飾的胞嘧啶的位置的一個或多個核苷酸的預定序列。在一個實施方案中，“引物”包含存在于與基于crispr的系統一起用于與預定序列雜交的指導rna中的序列。引物可包括核苷酸或其類似物的任何組合。在一些實施方案中，引物是單鏈寡核苷酸或多核苷酸。

22、術語“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”在本文中可互換使用，是指任何長度的核苷酸的聚合形式，并且可包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、它們的類似物或它們的混合物。這些術語應理解為包括由核苷酸類似物制成的dna、rna、cdna或抗體-寡核苷酸偶聯物的類似物作為等同物，并且適用于單鏈(諸如有義或反義)和雙鏈多核苷酸。如本文所用，該術語還涵蓋cdna，即由rna模板例如通過逆轉錄酶的作用產生的互補dna或拷貝dna。

23、如本文所用，“索引”(也稱為“索引區域”、“索引接頭”、“標簽”或“條形碼”)是指可用于識別核酸材料的樣品或來源的獨特核酸標簽，或其中存在靶核酸的隔室。索引可存在于溶液中、固體載體上，或附接到固體載體或與固體載體締合，并在溶液或隔室中釋放。當核酸樣品來源于多個來源時，每個核酸樣品中的核酸可用不同的核酸標簽加標簽，使得樣品的來源可被識別。可使用任何合適的索引或索引集，如本領域已知的并且如美國專利8,053,192、pct公布wo?05/068656和美國專利公布2013/0274117的公開內容所例示。在一些實施方案中，索引可包含得自illumina，inc.(san?diego，ca)的六堿基索引1(i7)序列、八堿基索引1(i7)序列、八堿基索引2(i5e)序列、十堿基索引1(i7)序列或十堿基索引2(i5)序列。

24、如本文所用，術語“擴增子”當用于提及核酸時，意指復制該核酸的產物，其中該產物具有與該核酸的核苷酸序列的至少一部分相同或互補的核苷酸序列。擴增子可通過使用核酸或其擴增子作為模板的多種擴增方法中的任一種產生，所述擴增方法包括例如聚合酶延伸、聚合酶鏈反應(pcr)、滾環擴增(rca)、連接延伸或連接酶鏈反應。擴增子可以是具有特定核苷酸序列的單拷貝(例如，pcr產物)或該核苷酸序列的多拷貝(例如，rca的串聯產物)的核酸分子。靶核酸的第一擴增子通常為互補拷貝。后續的擴增子是在生成第一擴增子后，由靶核酸或由第一擴增子形成的拷貝。后續的擴增子可具有與靶核酸基本上互補或與靶核酸基本上相同的序列。

25、如本文所用，“擴增”或“擴增反應”以及它們派生詞通常是指核酸分子的至少一部分被復制或拷貝到至少一個另外的核酸分子中的任何動作或過程。另外的核酸分子任選地包含與模板核酸分子的至少一些部分基本上相同或基本上互補的序列。模板核酸分子可為單鏈或的雙鏈的，并且另外的核酸分子可獨立地為單鏈的或雙鏈的。擴增通常是核酸分子的指數復制。在一些實施方案中，這種擴增可使用等溫條件進行；在其他實施方案中，這種擴增可包括熱循環。在一些實施方案中，擴增是多重擴增，其包括在單個擴增反應中同時擴增多個靶序列。在一些實施方案中，“擴增”包括單獨或組合擴增基于dna和rna的核酸的至少一些部分。擴增反應可包括本領域普通技術人員已知的任何擴增過程。在一些實施方案中，擴增反應包括聚合酶鏈反應(pcr)。

26、如本文所用，術語“聚合酶鏈反應”(“pcr”)是指mullis的美國專利4,683,195和4,683,202的方法，這些專利描述了用于在不進行克隆或純化的情況下增加基因組dna的混合物中所關注多核苷酸的區段的濃度的方法。該擴增所關注多核苷酸的方法包括將大量過量的兩種寡核苷酸引物引入包含所需所關注多核苷酸的dna混合物中，然后在存在dna聚合酶的情況下進行一系列熱循環。這兩種引物與它們各自的所關注雙鏈多核苷酸的鏈互補。首先將混合物在較高溫度下變性，然后將引物與所關注多核苷酸分子內的互補序列退火。退火后，用聚合酶延伸引物以形成一對新的互補鏈。變性、引物退火和聚合酶延伸的步驟可重復多次(稱為熱循環)，以獲得高濃度的期望的所關注多核苷酸的擴增片段。期望的所關注多核苷酸(擴增子)的擴增片段的長度由引物相對于彼此的相對位置確定，因此，該長度是可控參數。由于重復該過程，該方法被稱為pcr。因為所關注多核苷酸的期望擴增片段成為混合物中的主要核酸序列(就濃度而言)，所以認為它們是“pcr擴增的”。在上述方法的修改形式中，可使用多個不同的引物對(在一些情況下，每個所關注的靶核酸分子一個或多個引物對)pcr擴增靶核酸分子，從而形成多重pcr反應。

27、如本文所用，“擴增條件”及其派生詞通常是指適用于擴增一個或多個核酸序列的條件。在一些實施方案中，擴增條件可包括等溫條件，或者可包括熱循環條件，或者等溫條件和熱循環條件的組合。在一些實施方案中，適用于擴增一個或多個核酸序列的條件包括聚合酶鏈反應(pcr)條件。通常，擴增條件是指足以擴增核酸(諸如側接通用序列或靶特異性引物的一個或多個靶序列)或擴增側接一個或多個銜接子的擴增的靶序列的反應混合物。一般來講，擴增條件包括用于擴增或用于核酸合成的催化劑，例如聚合酶；與待擴增核酸具有一定程度互補性的引物；以及核苷酸，諸如脫氧核糖核苷酸三磷酸(dntp)，從而一旦與核酸雜交就促進引物的延伸。擴增條件可能需要引物與核酸的雜交或退火、引物的延伸和其中延伸的引物與經歷擴增的核酸序列分離的變性步驟。通常，但不是必須的，擴增條件可包括熱循環；在一些實施方案中，擴增條件包括多個循環，其中重復退火、延伸和分離的步驟。通常，擴增條件包括陽離子諸如mg2+或mn2+，并且還可包括各種離子強度改性劑。

28、如本文所定義，“多重擴增”是指使用至少一種靶標特異性引物對樣品內的兩個或更多個靶序列進行選擇性和非隨機擴增。在一些實施方案中，進行多重擴增，使得靶序列中的一些或全部在單個反應容器內擴增。給定多重擴增的“重數”或“重”通常是指在單個多重擴增期間擴增的不同靶標特異性序列的數量。在一些實施方案中，重數可為約12重、24重、48重、96重、192重、384重、768重、1536重、3072重、6144重或更高。還可通過幾種不同的方法來檢測擴增的靶序列(例如，凝膠電泳，然后進行密度測定法、用生物分析儀或定量pcr進行定量、用標記探針進行雜交；摻入生物素酰化的引物，然后進行親和素-酶偶聯物檢測；將32p標記的脫氧核苷酸三磷酸摻入擴增的靶序列中)。

29、如本文所用，術語“擴增位點”是指陣列中或陣列上可生成一個或多個擴增子的位點。擴增位點還可被配置為包含、保持或附接在該位點生成的至少一個擴增子。

30、如本文所用，術語“陣列”、“分析物陣列”和“微陣列”可互換使用，是指可根據相對位置彼此區分的一組位點。位于陣列的不同位點處的不同分子可根據位點在陣列中的位置而彼此區分。陣列的單個位點可包含一種或多種特定類型的分子。例如，位點可包含具有特定序列的單個靶核酸分子，或者位點可包含具有相同序列(和/或其互補序列)的若干核酸分子。陣列的位點可以是位于同一基底上的不同特征。示例性特征包括但不限于小滴、基板中的孔、基板中或基板上的小珠(或其他顆粒)、基板的突出部、基板上的脊或基板中的通道。陣列的位點可以是各自帶有不同分子的單獨的基底。可根據基底在與基底相關聯的表面上的位置，或者根據基底在液體或凝膠中的位置，來識別附接到單獨基底的不同分子。其中單獨的基底位于表面上的示例性陣列包括但不限于在孔中具有小珠的那些陣列。

31、如本文所用，術語“隔室”旨在表示將某物與其他事物分開或隔離的區域或體積。示例性隔室包括但不限于小瓶、管、孔、小滴、團塊、小珠、容器、表面特征部、流通池，或由物理力諸如流體流動、磁力、電流等分開的區域或體積。在一個實施方案中，隔室是多孔板(諸如96孔板或384孔板)的孔。如本文所用，小滴可包括水凝膠小珠，該水凝膠小珠是用于包封一個或多個細胞核或細胞的小珠并且包含水凝膠組合物。在一些實施方案中，小滴是水凝膠材料的均質小滴或者是具有聚合物水凝膠外殼的中空小滴。無論是均質的還是中空的，小滴均能夠包封一個或多個細胞核或細胞。在一些實施方案中，小滴是表面活性劑穩定的小滴。在一些實施方案中，每個隔室存在單個細胞或細胞核。在一些實施方案中，每個隔室存在兩個或更多個細胞或細胞核。在一些實施方案中，每個隔室含有隔室特異性索引。在一些實施方案中，該索引在溶液中或與每個隔室中的固相附接或締合。

32、如本文所用，術語“流通池”是指包括固體表面的室，一種或多種流體試劑可流過該固體表面。可以容易地用于本公開的方法中的流通池以及相關流體系統和檢測平臺的示例描述于例如以下文獻中：bentley等人，nature?456：53-59(2008)；wo?04/018497；us?7，057,026；wo?91/06678；wo?07/123744；us?7，329,492；us?7，211，414；us?7，315，019；us?7，405,281和us2008/0108082。

33、如本文所用，術語“克隆群體”是指相對于特定核苷酸序列而言是同源的核酸群體。同源序列通常為至少10個核苷酸長，但甚至可以更長，包括例如至少50、100、250、500或1000個核苷酸長。克隆群體可來源于單個靶核酸或模板核酸。通常，克隆群體中的所有核酸將具有相同的核苷酸序列。應當理解，在不脫離克隆性的情況下，少量突變(例如，由于擴增偽影(amplification?artifact))可發生在克隆群體中。

34、如本文所用，“胞嘧啶修飾的模式”(也稱為“甲基化譜”)是指半胱氨酸的甲基化和未甲基化均分布于細胞或生物體的基因組中的模式。“模式”包括經修飾的胞嘧啶和未經修飾的胞嘧啶兩者。該模式可以以若干分布維度定義：通過器官、通過組織、通過疾病的狀態或病理狀況(例如，癌癥、神經生理)、通過基因組區段(例如，染色體或染色體上的遺傳坐標)、通過基因、通過cpg島、一組胞嘧啶或通過經修飾的胞嘧啶的位點。胞嘧啶修飾的模式可與疾病或病理狀況具有已知相關性，或者胞嘧啶修飾的模式與疾病或病理狀況的相關性可使用本文所述的方法來鑒定。胞嘧啶修飾的模式可存在于基因組中的特定座位(例如，位置)處，并且該特定位置可以是單個經修飾的胞嘧啶或一組經修飾的胞嘧啶，例如cpg島。胞嘧啶修飾的模式可以通過使用預定的序列來鑒定，例如，使用經改變的胞苷脫氨酶的方法可以被設計和實施，目的是確定胞嘧啶修飾的模式，例如，一個或多個特定胞嘧啶的甲基化狀態、存在于基因組的特定位置處的一個或多個特定胞嘧啶的甲基化狀態或者它們的組合。

35、如本文所用，術語“每個”當用于提及項目的集合時，旨在識別集合中的單個項目，但不一定是指集合中的每個項目，除非上下文中另外明確指出。

36、如本說明書和所附權利要求書中所使用的，除非上下文另外明確指出，否則術語“或”通常以包括“和/或”的含義被采用。術語“和/或”意指所列元素中的一個或全部元素，或所列元素中的任何兩個或更多個元素的組合。在一些情況下，使用“和/或”并不暗示在其他情況下使用“或”可能不意味著“和/或”。

37、除非另外指明，否則“一個”、“一種”、“該”和“至少一個”可互換使用，表示一個或多于一個。

38、如本說明書和所附權利要求書中所使用的，除非上下文另外明確指出，否則術語“或”通常以包括“和/或”的含義被采用。術語“和/或”意指所列元素中的一個或全部元素，或所列元素中的任何兩個或更多個元素的組合。在一些情況下，使用“和/或”并不暗示在其他情況下使用“或”可能不意味著“和/或”。

39、詞語“優選的”和“優選地”是指在某些情況下可提供某些益處的本公開的實施方案。然而，在相同或其他情況下，其他實施方案也可以是優選的。此外，對一個或多個優選實施方案的表述并不暗示其他實施方案是不可用的，并且并非旨在將其他實施方案排除在本公開的范圍之外。

40、如本文所用，“具有”、“包括”、“包含”等以它們的開放式包含性意義使用，并且通常意指“包括但不限于”。

41、應當理解，在本文以語言“具有”、“包括”、“包含”等描述實施方案的任何地方，還提供了以“由......組成”和/或“基本上由......組成”描述的其他類似實施方案。術語“由......組成”意指包括并限于短語“由......組成”之后的任何內容。也就是說，“由......組成”指示所列元素是必需的或強制性的，并且不存在其他要素。術語“基本上由......組成”指示包括該短語之后列出的任何元素，并且可包括除列出的那些元素之外的其他元素，條件是那些元素不干擾或有助于所列元素的公開內容中指定的活動或動作。

42、用于待發生事件(諸如通過脫氨將5甲基胞嘧啶轉化為胸苷)的“適合”的條件或“合適的”條件是不阻止此類事件發生的條件。因此，這些條件允許、增強、促進和/或有利于事件。

43、如本文所用，在蛋白質、dna或rna的樣品、或者組合物的上下文中，“提供”意指制備蛋白質、dna或rna的樣品、或者組合物，購買蛋白質、dna或rna的樣品、或者組合物，或者獲得蛋白質、dna或rna的樣品、或者組合物。

44、本說明書通篇提及的“一個實施方案”、“實施方案”、“某些實施方案”或“一些實施方案”等意指結合該實施方案描述的特定特征、構型、組成或特性包括在本公開的至少一個實施方案中。因此，本說明書通篇的多處出現的此類短語不一定指本公開的相同實施方案。此外，在一個或多個實施方案中，特定特征、構型、組成或特性可以任何合適的方式組合。

45、雖然編碼經改變的胞苷脫氨酶、解旋酶或融合蛋白的多核苷酸序列在本文中被描述為dna序列，但應當理解，dna序列的互補序列、反向序列和反向互補序列可由技術人員容易地確定。還應當理解，本文描述為dna序列的序列可通過用尿嘧啶核苷酸替換每個胸苷核苷酸而從dna序列轉化為rna序列。

46、在整個本公開中，本公開的各個方面可以范圍格式呈現。應當理解，范圍格式的描述僅僅是為了方便和簡潔起見，而不應被解釋為對本公開的范圍的非靈活限制。因此，對范圍的描述應被認為具有具體公開的所有可能的子范圍以及該范圍內的單個數值。例如，對范圍諸如1至6的描述應被認為具有具體公開的子范圍(諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等)，以及該范圍內的單個數字，例如1、2、2.7、3、4、4.5、5、5.3和6。無論范圍的廣度如何，這都適用。

47、在本文的描述中，為清晰起見，可以孤立地描述特定實施方案。除非另外明確指明特定實施方案的特征與另一實施方案的特征不相容，否則某些實施方案可包括本文結合一個或多個實施方案描述的相容特征的組合。

48、對于本文所公開的包括離散步驟的任何方法，這些步驟可以任何可行的順序進行。并且，視情況而定，兩個或更多個步驟的任何組合可同時進行。

49、本公開的上述
技術實現要素：
并非旨在描述本公開的每個所公開的實施方案或每種具體實施。以下描述更具體地舉例說明了例示性實施方案。在本技術全文的若干地方，通過示例的列表提供了指導，這些示例可以各種組合使用。在每種情況下，所引用的列表僅用作代表性的組，并且不應理解為排他性列表。