本發明屬于植物基因工程，特別涉及一種農桿菌介導的燈盞花遺傳轉化體系的構建方法。

背景技術：

1、燈盞花，學名為短葶飛蓬(erigeron?breviscapus)，菊科飛蓬屬，多生長于草地、亞高山開曠山坡、中山和林緣。由于燈盞花適應性強，自然繁殖力高，野生資源有較大分布，其中文山州、紅河州分布較廣。燈盞花作為云南特有的野生天然藥用植物，它的醫藥價值很高，全株可入藥。其具有散寒解表，祛風除濕，活絡止痛，擴張血管，改善腦血循環等作用，臨床上常用燈盞花的口服或靜脈滴注制劑來治療或輔助治療冠心病，心絞痛等心腦血管疾病。目前燈盞花被認為是治療閉塞性腦血管疾病和腦溢血后遺癥最為有效的天然藥物。燈盞花現存的野生數量有限，并且常見品種單株燈盞乙素含量較低，現有栽培種都是短期馴化得到，各種抗性都較差，而由于燈盞花在心腦血管疾病方面的顯著療效就使它的市場需求量大增，現在每年對于燈盞花的需求量達到了一萬噸以上并且還在增長，已經遠超出了現有的燈盞花產量。因此，培育高產、有效成分含量高、抗逆、抗病等的優良燈盞花品種是現在亟需解決的問題。

2、燈盞花遺傳轉化效率低的主要因素是組織培養中再生效率較低，而利用促再生基因可以在一定程度上克服再生率低和遺傳轉化效率低的問題。研究表明，通過異位過表達促再生基因如wuschel-related?homeobox(wus)基因、baby?boom?(bbm)基因、growth-regulating?factors?(grf)基因等來提高植物的遺傳轉化效率和建立基因編輯體系是一種切實可行的有效途徑，目前在小麥、玉米、蘋果、西瓜等多種植物上已有報導，但在燈盞花遺傳轉化和基因編輯體系上的應用還尚未見報道。

3、本發明過表達燈盞花促再生基因ebgrf4優化了農桿菌介導的燈盞花遺傳轉化體系。農桿菌介導的遺傳轉化體系是培育新型燈盞花最為重要的一步，同時也是燈盞花基因功能研究的重要技術手段。建立燈盞花農桿菌介導高效轉化體系意味著能夠突破燈盞花自身遺傳屏障，獲得難以通過傳統育種方式生產的新品種。

技術實現思路

1、針對上述問題，本發明的目的是提供一種農桿菌介導的燈盞花遺傳轉化體系的構建方法。

2、為實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：

3、首先根據系統進化樹同源性分析,選取與擬南芥atgrf4高同源性的燈盞花ebgrf4基因序列進行擴增引物設計，采用rna試劑盒提取燈盞花的rna，并反轉成cdna后進行pcr擴增獲得。

4、所述ebgrf4基因的核酸序列如seq?id?no：1所示。

5、本發明還提供ebgrf4基因所編碼的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq?id?no：2所示。

6、所述ebgrf4基因的擴增引物如下所示：

7、5'f：atggggaatgggaataatat

8、3'r：cctaaggtcacgtccatggc

9、本發明還提供了一種重組質粒，通過將上述的ebgrf4基因與載體1300-gfp同源重組獲得，命名為1300-ebgrf4-gfp。

10、此外，與載體1300-gfp進行同源重組時，ebgrf4基因則需要使用帶同源臂的引物進行擴增及回收，帶同源臂的引物如下：

11、5'f：ctcgagctttcgcgaatggggaatgggaataatat

12、3'r：atgagtaatgtttgggtacccctaaggtcacgtccatggc

13、本發明還提供了一種轉基因工程菌，含有上述的重組質粒1300-ebgrf4-gfp或所述轉基因工程菌的基因組中整合有上述外源燈盞花ebgrf4基因。

14、作為優選，所述轉基因工程菌為大腸桿菌dh5α菌株和根癌農桿菌eha105菌株。

15、將構建的重組質粒1300-ebgrf4-gfp通過電轉化轉入大腸桿菌dh5α，經過菌落pcr篩選并提取質粒進行sanger測序，確認載體構建成功。接著將重組質粒1300-ebgrf4-gfp轉化農桿菌eha105，經過菌落pcr篩選陽性克隆，之后進行轉基因，得到1300-ebgrf4-gfp農桿菌。

16、將燈盞花葉片外植體置于含有1300-ebgrf4-gfp農桿菌轉基因侵染液中進行侵染，再分別依次置于燈盞花共培養基、恢復培養基、篩選培養基中進行培養，獲得新增殖愈傷組織；

17、所述轉基因侵染液的制備方法包括以下步驟：將含有重組質粒1300-ebgrf4-gfp的陽性農桿菌單菌落加入5ml含kan（50mg/l）和rif（50mg/l）的lb液體培養基中，28℃，200rpm搖床過夜培養，吸取菌液500μl于50ml于含kan（50mg/l）和rif（50mg/l）的lb液體培養基中，28℃，200rpm搖床培養至菌液od600值為0.6~0.8，5000rpm室溫離心8min收集菌體，棄上清，在超凈工作臺中加入重懸液配成侵染液，使od600值為0.2~0.3。

18、本發明還提供了一種燈盞花轉基因植株的培養方法：將燈盞花葉片外植體置于轉基因侵染液中進行侵染，再分別依次置于燈盞花共培養基、恢復培養基、篩選培養基中進行培養，獲得新增殖愈傷組織；將所述新增殖愈傷組織轉接到芽起始培養基中誘導小芽，再在芽分化培養基中培養分化為抗性苗，再轉接到生根培養基中，得到轉基因植株。

19、優選的，所述芽起始培養基由以下組分制成：sh、0.001mg/ml6-ba、0.001mg/mlnaa、0.08g/l?ad、0.05g/l?giu、2g/l?ch、3%蔗糖+0.8%瓊脂、0.27mg/ml?tmt、5mg/l?hyg；

20、所述芽分化培養基由以下組分制成：ms、0.0005mg/ml?kt、0.0003mg/ml?naa、3%蔗糖、0.8%瓊脂、0.27mg/ml?tmt、5mg/l?hyg；所述分化培養的條件均為：22～26℃光照培養，每天光照12～14h，光照強度5000lx；

21、所述生根培養基由以下組分制成：ms、0.1mg/lnaa、1%蔗糖、0.8%瓊脂、0.27mg/mltmt；所述生根培養的條件為：22～26℃光照培養，光照強度為5000lx，每天光照時間12～14h。

22、優選的，所述燈盞花外植體的制備方法包括以下步驟：

23、（1）種植無菌苗；將消毒滅菌后的燈盞花種子分別依次接種于ms基礎培養基、種子發芽培養基、生根培養基中培養，得到無菌苗；

24、（2）制備燈盞花外植體；將萌發20～30天的無菌苗的葉片取出，在潤濕的濾紙上切成2-5mm大小的塊，放置于燈盞花愈傷組織誘導培養基上，葉片正面朝上。預培養一天，得到燈盞花葉片外植體，接著用葉片外植體來做轉基因侵染。

25、優選的，所述燈盞花種子的消毒殺菌方法為：將燈盞花的種子在75％乙醇中浸泡30s，再使用無菌水清洗3～5次，在0.1～0.2％次氯酸鈉中浸泡3～15min，再使用無菌水清洗種子5～8次，種子放在濾紙上晾干。

26、優選的，所述ms基礎培養的條件為：22～26℃光照培養，每天光照12～14h，光照強度5000lx，培養時間20～30天；

27、所述的種子發芽培養基由以下組分制成：ms、3%蔗糖、0.8%瓊脂；

28、所述的生根培養基由以下組分制成：ms、0.1mg/l?naa、1%蔗糖、0.8%瓊脂、0.27mg/ml?tmt；生根培養條件：22～26℃光照培養，光照強度為5000lx，每天光照時間12～14h。

29、優選的，所述的愈傷組織誘導培養基由以下組分制成：ms、0.004mg/ml?6-ba、0.0005mg/ml?tdz、0.002mg/ml?naa、3%蔗糖、0.8%瓊脂；愈傷組織誘導培養條件為：22～26℃光照培養1個月，每天光照12～14h，光照強度5000lx。

30、優選的，所述的燈盞花共培養基由以下組分制成：ms+0.004mg/ml?6-ba+0.0005mg/ml?tdz+0.002mg/ml?naa+3%蔗糖+0.8%瓊脂+100μmol/l?as；共培養為暗培養，培養溫度為22～25℃，培養時間為2～3天；

31、所述的恢復培養基由以下組分制成：ms+0.004mg/ml?6-ba+0.0005mg/ml?tdz+0.002mg/ml?naa+3%蔗糖+0.8%瓊脂+0.27mg/ml?tmt；恢復培養條件為：22～25℃光照培養，每天光照12～14h，光照強度5000lx，培養14天；

32、所述的篩選培養基由以下組分制成：ms+0.002mg/ml?6-ba+0.005mg/ml?tdz+0.001mg/ml?naa+3%蔗糖+0.8%瓊脂+0.27mg/ml?tmt+10mg/l?hyg；篩選培養條件如下：22～26℃光照培養，每天光照12～14h，光照強度5000lx，培養20～50天；2周繼代一次，直至長出綠色愈傷。

33、優選的，所述的lb液體培養基由以下組分制成：蛋白胨10～20g/l、酵母提取物5～10g/l、氯化鈉10～20g/l。

34、優選的，所述的as母液溶液濃度為200mm。

35、本發明具有以下有益效果：

36、本發明檢測的抗性植株對于潮霉素具有一定的抗性，證明導入的潮霉素抗性基因已經表達。篩選之后分化所得的陽性苗經過陽性pcr驗證，證實了本發明中通過農桿菌遺傳介導的方法能將外源基因引入燈盞花基因組。因此，采用此方法進行燈盞花的誘導愈傷組織及農桿菌介導的高效轉化，可以使燈盞花快速獲得目的性狀，而且可以突破燈盞花自身遺傳屏障，獲得難以通過傳統育種方式生產的新品種。

37、燈盞花的轉基因體系的重點在于共培養、篩選、分化和生根培養等過程。根據研究，發現在本發明提供的侵染條件下容易打破其基因屏障，農桿菌能夠成功介導燈盞花，且本發明采用的激素配方以及培養時間比較適合侵染后的燈盞花共培養、篩選、分化等，愈傷組織形成頻率較高。本發明中燈盞花愈傷組織分化率達66.08％-75.17％，芽再生效率高達58.94％-69.72％，轉化效率高達45％，可以滿足燈盞花育種需求，適合大規模工業生產和商業育種。