本發(fā)明涉及包含孔單體和官能化伴侶分子的新穎孔單體綴合物、由該綴合物形成的孔復(fù)合物以及它們在分析物檢測和表征中的用途。
背景技術(shù)：
1、納米孔感測是分析物檢測和表征方法，其依賴于對分析物分子與離子傳導(dǎo)通道之間的單獨(dú)結(jié)合或相互作用事件的觀察結(jié)果。使用納米孔感測進(jìn)行分析物表征的基本組分中的兩者是(1)控制分析物移動(dòng)通過孔，以及(2)在分析物移動(dòng)通過孔時(shí)辨別組成結(jié)構(gòu)單元。在納米孔感測期間，孔的最窄部分形成納米孔的關(guān)于作為通過的分析物的函數(shù)的電流特征的最具辨別力的部分。csgg被鑒定為來自大腸桿菌的非門控、非選擇性蛋白質(zhì)分泌通道(goyal等人,2014)，并且已經(jīng)用作用于檢測和表征分析物的納米孔。還公開了在這種情況下改善孔的特性的野生型csgg孔的突變(wo?2016/034591、wo?2017/149316、wo?2017/149317、wo?2017/149318、wo?2018/211241和wo?2019/002893，其通過引用以其整體并入本文)。
2、已經(jīng)開發(fā)了用于對雙鏈多核苷酸進(jìn)行測序的方法，例如，涉及由發(fā)夾連接的模板和補(bǔ)體鏈兩者的易位。以這種方式測量兩條鏈?zhǔn)怯欣模驗(yàn)閬碜詢蓷l互補(bǔ)連接的鏈的信息可以被組合并且用于提供比僅可以通過測量模板鏈獲得的更高置信度的觀察結(jié)果。然而，制備此類發(fā)夾連接的多核苷酸會(huì)增加樣品制備時(shí)間并導(dǎo)致有價(jià)值的分析物的損失。此外，發(fā)夾連接的模板和補(bǔ)體多核苷酸鏈通過納米孔的易位會(huì)導(dǎo)致在納米孔的另一側(cè)(反式)鏈的重新雜交。這會(huì)改變易位率，導(dǎo)致較低的測序準(zhǔn)確度。此外，由于模板鏈和補(bǔ)體鏈的當(dāng)前時(shí)間數(shù)據(jù)的差異，使用兩種算法用于計(jì)算，這使得計(jì)算更加復(fù)雜和密集。在wo?2018/100370中描述了以提高的準(zhǔn)確性和更高的效率/吞吐量來表征雙鏈多核苷酸的改進(jìn)的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，伴侶分子可以用于官能化孔單體，并且由這些官能化的孔單體形成的孔復(fù)合物具有改進(jìn)的確定目標(biāo)分析物的存在、不存在或一種或多種特征的能力。例如，在下面的實(shí)例中，發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地顯示了csga伴侶多肽可以用于用孔系繩使csgg孔功能化，并增加該孔對雙鏈多核苷酸的總讀取百分比。本發(fā)明的孔單體和孔可以與各種不同的應(yīng)用結(jié)合使用，如下面更詳細(xì)描述的。因此，本發(fā)明提供了一種孔單體綴合物，該孔單體綴合物包含孔單體、伴侶分子和功能性結(jié)合部分，其中伴侶分子對孔單體具有親和力，并且其中功能性結(jié)合部分經(jīng)由伴侶分子連接至孔單體。
2、本發(fā)明還提供了：
3、-一種構(gòu)建體，其包含兩個(gè)或更多個(gè)共價(jià)附著的本發(fā)明的孔單體綴合物；
4、-一種孔復(fù)合物，該孔復(fù)合物包含至少一個(gè)本發(fā)明的孔單體綴合物或至少一個(gè)本發(fā)明的構(gòu)建體；
5、-一種孔多聚體，其包含兩個(gè)或更多個(gè)孔，其中孔中的至少一者是本發(fā)明的孔復(fù)合物；
6、-一種膜，其包含本發(fā)明的孔復(fù)合物或本發(fā)明的孔多聚體；
7、-一種用于確定目標(biāo)分析物的存在、不存在或一種或多種特征的方法，該方法包括以下步驟：
8、(i)使目標(biāo)分析物與本發(fā)明的孔復(fù)合物或本發(fā)明的孔多聚體接觸，使得目標(biāo)分析物相對于孔復(fù)合物或孔多聚體移動(dòng)；以及
9、(ii)在目標(biāo)分析物相對于孔復(fù)合物或孔多聚體移動(dòng)時(shí)進(jìn)行一次或多次測量，并且從而確定目標(biāo)分析物的存在、不存在或一種或多種特征。
10、-本發(fā)明的孔復(fù)合物或本發(fā)明的孔多聚體用于確定目標(biāo)分析物的存在、不存在或一種或多種特征的用途；
11、-一種用于表征目標(biāo)分析物的試劑盒，該試劑盒包括(a)本發(fā)明的孔復(fù)合物或本發(fā)明的孔多聚體以及(b)膜的組分；
12、-一種用于表征目標(biāo)多核苷酸或目標(biāo)多肽的試劑盒，該試劑盒包含(a)本發(fā)明的孔復(fù)合物或本發(fā)明的孔多聚體以及(b)多核苷酸結(jié)合蛋白或多肽結(jié)合蛋白；
13、-一種用于表征樣品中的目標(biāo)多核苷酸或目標(biāo)多肽的設(shè)備，該設(shè)備包含(a)多個(gè)本發(fā)明的孔復(fù)合物或多個(gè)本發(fā)明的孔多聚體以及(b)多個(gè)多核苷酸結(jié)合蛋白或多個(gè)多肽結(jié)合蛋白；
14、-一種陣列，其包含多個(gè)本發(fā)明的膜；
15、-一種系統(tǒng)，其包括(a)本發(fā)明的膜或本發(fā)明的陣列，(b)用于跨膜施加電勢的裝置，
16、以及(c)用于檢測跨膜的電信號(hào)或光信號(hào)的裝置；
17、-一種設(shè)備，其包括插入體外膜中的本發(fā)明的孔復(fù)合物或本發(fā)明的孔多聚體；
18、-一種設(shè)備，其通過包括以下的方法生產(chǎn)：(i)獲得本發(fā)明的孔復(fù)合物或本發(fā)明的孔多聚體；以及(ii)使孔復(fù)合物或孔多聚體與體外膜接觸，使得孔復(fù)合物或孔多聚體插入體外膜中；
19、-一種孔單體綴合物，該孔單體綴合物包含csgg孔單體、伴侶分子和功能性結(jié)合部分，
20、其中csgg孔單體包含在整個(gè)序列上與seq?id?no:3的氨基酸序列至少約40％同源或相同的序列，
21、其中伴侶分子包含seq?id?no:21、23、25、27、29、31、63、64、65、66、67或68，
22、其中seq?id?no:21、23、25、27、29或31的位置7處的k通過磺酰基基團(tuán)共價(jià)連接至csgg孔單體，或者seq?id?no:63、64、65、66、67或68的位置8處的k通過磺酰基基團(tuán)共價(jià)連接至csgg孔單體，
23、其中功能性結(jié)合部分包含能夠與目標(biāo)多核苷酸分析物特異性雜交的寡核苷酸、多核苷酸、多核苷酸類似物或嗎啉代，并且
24、其中功能性結(jié)合部分與seq?id?no:21、23、25、27、29、31、63、64、65、66、67或68的c末端k共價(jià)連接；以及
25、-一種確定目標(biāo)多核苷酸的存在、不存在或一種或多種特征的方法，該方法包括以下步驟：(a)使包含模板和補(bǔ)體鏈的雙鏈多核苷酸與包含至少一個(gè)本發(fā)明的孔單體綴合物的孔復(fù)合物或孔多聚體接觸，其中補(bǔ)體鏈包含能夠與功能性結(jié)合部分雜交的結(jié)合區(qū)，使得當(dāng)模板鏈移動(dòng)穿過孔復(fù)合物或孔多聚體時(shí)兩條鏈分離以露出補(bǔ)體鏈上的結(jié)合區(qū)，其中功能性結(jié)合部分與結(jié)合區(qū)雜交以便促進(jìn)通過所述孔復(fù)合物或孔多聚體捕獲補(bǔ)體鏈；以及(b)當(dāng)模板鏈和補(bǔ)體鏈相對于孔復(fù)合物或孔多聚體移動(dòng)時(shí)進(jìn)行一次或多次測量，其中模板鏈和補(bǔ)體鏈兩者的測量用于確定目標(biāo)多核苷酸的存在、不存在或一種或多種特征。
1.一種孔單體綴合物，其包含csgg孔單體、伴侶分子和功能性結(jié)合部分，其中所述伴侶分子包括選自csga多肽、csgb多肽、csgc多肽、csgd多肽和csge多肽的多肽，并且其中所述功能性結(jié)合部分經(jīng)由所述伴侶分子連接至所述孔單體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的孔單體綴合物，其中所述伴侶分子包括選自csga多肽、csgb多肽和csge多肽的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的孔單體綴合物，其中所述伴侶分子包括csga多肽。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的孔單體綴合物，其中所述功能性結(jié)合部分被共價(jià)連接至所述伴侶分子，任選地通過接頭被共價(jià)連接至所述伴侶分子。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的孔單體綴合物，其中所述功能性結(jié)合部分能夠結(jié)合目標(biāo)分析物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的孔單體綴合物，其中所述目標(biāo)分析物包括多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、多核苷酸、多核苷酸-多肽綴合物、寡糖或多糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的孔單體綴合物，其中所述功能性結(jié)合部分包括寡核苷酸、多核苷酸、多核苷酸類似物、嗎啉代、肽核酸、多肽、配體、環(huán)糊精、單糖、寡糖、多糖、硼酸、酶、肽、作為功能性的環(huán)肽、抗體或其片段或適體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的孔單體綴合物，其中所述功能性結(jié)合部分能夠結(jié)合至多核苷酸結(jié)合蛋白、多肽結(jié)合蛋白、孔單體、適體、環(huán)狀蛋白或dna折紙結(jié)構(gòu)。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的孔單體綴合物，其中所述伴侶分子被共價(jià)連接至所述孔單體，任選地通過接頭被共價(jià)連接至所述孔單體。
10.一種構(gòu)建體，其包含兩個(gè)或更多個(gè)共價(jià)連接的根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的孔單體綴合物。
11.一種孔復(fù)合物，其包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的孔單體綴合物或至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求10所述的構(gòu)建體。
12.一種孔多聚體，其包含兩個(gè)或更多個(gè)孔，其中所述孔中的至少一者是根據(jù)權(quán)利要求11所述的孔復(fù)合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的孔復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求12所述的孔多聚體，其包含在膜中。
14.一種膜，其包含根據(jù)權(quán)利要求11所述的孔復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求12所述的孔多聚體。
15.一種用于使用對孔單體具有親和力的伴侶分子作為接頭將功能性結(jié)合部分連接至所述孔單體的方法。
16.一種用于確定目標(biāo)分析物的存在、不存在或一種或多種特征的方法，所述方法包括以下步驟：
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述目標(biāo)分析物如權(quán)利要求6中所定義。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述功能性結(jié)合部分與所述目標(biāo)分析物相互作用或結(jié)合至所述目標(biāo)分析物，并促進(jìn)其相對于所述孔復(fù)合物或多聚體的移動(dòng)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中(a)所述目標(biāo)分析物是多核苷酸，并且所述功能性結(jié)合部分包括能夠與所述目標(biāo)多核苷酸雜交的寡核苷酸、多核苷酸、多核苷酸類似物或嗎啉代，(b)所述目標(biāo)分析物是多核苷酸，并且所述功能性結(jié)合部分連接至多核苷酸結(jié)合蛋白，所述多核苷酸結(jié)合蛋白控制所述目標(biāo)分析物相對于所述孔復(fù)合物或孔多聚體的移動(dòng)，(c)所述目標(biāo)分析物是酶的配體，并且所述功能性結(jié)合部分連接至所述酶，或者(d)所述功能性結(jié)合部分是與所述目標(biāo)分析物結(jié)合的抗體或其功能片段或適體。
20.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中(i)所述功能性結(jié)合部分連接至孔、適體、環(huán)狀蛋白或dna折紙結(jié)構(gòu)，以增加多核苷酸結(jié)合蛋白與所述孔復(fù)合物或孔多聚體之間的距離或提供一個(gè)或多個(gè)額外的收縮，(ii)所述功能性結(jié)合部分結(jié)合至所述孔復(fù)合物或孔多聚體以穩(wěn)定順式環(huán)并降低所述孔復(fù)合物或孔多聚體的信噪比，或(iii)所述功能性結(jié)合部分將所述孔復(fù)合物或孔多聚體連接至第二孔或第二孔多聚體。
21.一種使用根據(jù)權(quán)利要求11所述的孔復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求12所述的孔多聚體來表征目標(biāo)分析物的方法。
22.根據(jù)權(quán)利要求11所述的孔復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求12所述的孔多聚體用于確定目標(biāo)分析物的存在、不存在或一種或多種特征的用途。
23.一種用于表征目標(biāo)分析物的試劑盒，所述試劑盒包括(a)根據(jù)權(quán)利要求11所述的孔復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求12所述的孔多聚體，以及(b)膜的組分。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中所述試劑盒進(jìn)一步包括酶、孔、孔多聚體、適體、環(huán)狀蛋白或dna折紙結(jié)構(gòu)。
25.一種用于表征目標(biāo)多核苷酸或目標(biāo)多肽的試劑盒，所述試劑盒包括(a)根據(jù)權(quán)利要求11所述的孔復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求12所述的孔多聚體，以及(b)多核苷酸結(jié)合蛋白或多肽結(jié)合蛋白。
26.一種用于表征樣品中的目標(biāo)多核苷酸或目標(biāo)多肽的設(shè)備，所述設(shè)備包括(a)多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求11所述的孔復(fù)合物或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求12所述的孔多聚體，以及(b)多個(gè)多核苷酸結(jié)合蛋白或多個(gè)多肽結(jié)合蛋白。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的試劑盒或根據(jù)權(quán)利要求26所述的設(shè)備，其中所述功能性結(jié)合部分能夠結(jié)合所述多核苷酸結(jié)合蛋白或所述多肽結(jié)合蛋白。
28.一種陣列，其包括多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求14所述的膜。
29.一種系統(tǒng)，其包括(a)根據(jù)權(quán)利要求14所述的膜或根據(jù)權(quán)利要求28所述的陣列，(b)用于跨所述膜施加電勢的裝置，以及(c)用于檢測跨所述膜的電信號(hào)或光信號(hào)的裝置。
30.一種設(shè)備，其包括插入到體外膜中的根據(jù)權(quán)利要求11所述的孔復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求12所述的孔多聚體。
31.一種設(shè)備，其通過包括以下的方法生產(chǎn)：(i)獲得根據(jù)權(quán)利要求11所述的孔復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求12所述的孔多聚體，以及(ii)使所述孔復(fù)合物或孔多聚體與體外膜接觸，使得所述孔復(fù)合物或所述孔多聚體插入到所述體外膜中。
32.一種孔單體綴合物，其包含csgg孔單體、伴侶分子和功能性結(jié)合部分，
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的孔單體，其中所述伴侶分子包含seq?id?no:21。
34.一種確定目標(biāo)多核苷酸的存在、不存在或一種或多種特征的方法，所述方法包括以下步驟：(a)使包含模板鏈和補(bǔ)體鏈的雙鏈多核苷酸與包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1至9、32和33中任一項(xiàng)所述的孔單體綴合物的孔復(fù)合物或孔多聚體接觸，其中所述補(bǔ)體鏈包含能夠與所述功能性結(jié)合部分雜交的結(jié)合區(qū)，使得當(dāng)所述模板鏈移動(dòng)穿過所述孔復(fù)合物或孔多聚體時(shí)兩條鏈分離以露出所述補(bǔ)體鏈上的所述結(jié)合區(qū)，其中所述功能性結(jié)合部分與所述結(jié)合區(qū)雜交以便促進(jìn)通過所述孔復(fù)合物或孔多聚體捕獲所述補(bǔ)體鏈；以及(b)當(dāng)所述模板鏈和所述補(bǔ)體鏈相對于所述孔復(fù)合物或孔多聚體移動(dòng)時(shí)進(jìn)行一次或多次測量，其中所述模板鏈和補(bǔ)體鏈兩者的測量用于確定所述目標(biāo)多核苷酸的存在、不存在或一種或多種特征。