專利名稱：乙基紫在dna檢測中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及乙基紫(EV)在聚丙烯酰 胺凝膠上對DNA染色的方法，其成本低、步驟簡單、操作時間短、靈敏度高而且染色后 的背景顏色淺。另外，本發(fā)明還涉及檢測DNA的方法以及用于這些方法的試劑盒等。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，在聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子并使之條帶顯 色(可視化)，已經(jīng)成為生物檢測中最常用的方法之一了。其中，使在聚丙烯酰胺凝膠 上的DNA分子條帶可視 化，可以采用同位素標(biāo)記、熒光染料、可視有機(jī)染料和銀染等。 出于靈敏性、安全性以及速度的考慮，當(dāng)前最受歡迎的技術(shù)之一是熒光檢測法，其使用 諸如溴化乙錠(EB)、SYBR green, SYBR gold等熒光染料，如紫外光線(UV)的照射下 發(fā)出熒光，可用于檢測聚丙烯酰胺凝膠上的DNA條帶[1-5]。然而，這些熒光染料都具 有一些不可克服的缺點(diǎn)，尤其是EB，作為一種較強(qiáng)的致突變劑，容易對操作者的健康產(chǎn) 生威脅，因而需要在操作中格外小心并采取適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施，不方便使用，而且所有熒 光染料在使DNA條帶可視化時，需要紫外線等短波光線照射，也不利于觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果的 操作者的健康，同時熒光檢測儀器設(shè)備成本也比較高[6-8]。因此，肉眼可見、操作簡單、無毒、低成本的可視有機(jī)染料成為替代熒光染料 為DNA染色的選擇之一。已經(jīng)有一些報(bào)道公開了可視有機(jī)染料用于聚丙烯酰胺凝膠上 DNA的染色方法，如亞甲藍(lán)[9]、亮甲酚藍(lán)[10]、結(jié)晶紫[11]、以及尼羅河藍(lán)[12，13] 等。但是，這些染料染色和脫色時間長，而且靈敏度較低，普遍不如熒光染料。為此，本發(fā)明人經(jīng)過長期實(shí)踐研究，令人驚訝地在發(fā)現(xiàn)成本低的乙基紫(ethyl violet, EV)可用于在聚丙烯酰胺凝膠上對DNA染色，其可以在20分鐘的染色時間內(nèi)檢 測出低至0.8-1.6ng級的DNA，靈敏度是尼羅藍(lán)(NB)的四倍，近似甚至超過EB等熒光染 料的靈敏度。EV在現(xiàn)有技術(shù)中被報(bào)道用于對哺乳動物組織、蛋白質(zhì)進(jìn)行染色[14-17]， 但是未見有報(bào)道用于對聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離的DNA染色。本發(fā)明人還優(yōu)化出了使 用EV對在聚丙烯酰胺凝膠上對DNA染色的方法，其可以在短至20分鐘的時間內(nèi)以染色 這樣簡單的步驟完成而仍舊能夠保持近似甚至超過EB等熒光染料的靈敏度。另外，本發(fā) 明人還發(fā)明了基于上述染色法的檢測DNA的方法以及用于這些方法的試劑盒等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供EV染色法，其能對在聚丙烯酰胺凝膠中的DNA染色， 該方法安全、操作方便、成本低，而且靈敏度高，達(dá)到甚至超過EB等熒光染料的靈敏 度。另外，本發(fā)明的目的還在于提供檢測DNA的方法以及用于這些方法的試劑盒等。具體而言，在第一方面，本發(fā)明的目的在于提供在聚丙烯酰胺凝膠上對DNA染 色的方法，其特征在于，所述方法包括將聚丙烯酰胺凝膠浸入pH為5.5-9的含乙基紫的 染色液中染色。本發(fā)明第一方面的方法通常在聚丙烯酰胺凝膠電泳分離DNA后使用，對 聚丙烯酰胺凝膠上的DNA條帶進(jìn)行染色，盡管不優(yōu)選，但是該方法也可以在用其他方式使DNA包裹在聚丙烯酰胺凝膠中之后使用。

EV是一種無毒性的三苯甲烷染料，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā) 現(xiàn)，EV的分子結(jié)構(gòu)和DNA分子具有很強(qiáng)的親和力，但是EV分子結(jié)構(gòu)和聚丙烯酰胺結(jié)合 的能力則弱得多，從而能夠使DNA(相對于聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì))顯出顏色；而且其對 DNA的顯色能力受pH這樣的環(huán)境因素影響很大。如圖2B所示，在小于5.5的酸性環(huán)境 下以及在大于9的堿性環(huán)境下，EV對DNA的顯色強(qiáng)度都急劇下降。在酸性環(huán)境下的下 降可能是由于DNA骨架上的磷酸基團(tuán)上所帶的負(fù)電荷被質(zhì)子化了，使得DNA與EV之間 缺乏靜電力的作用，從而EV難以和DNA通過靜電力作用而顯色了；而在堿性環(huán)境下的 下降，由于EV與OH_發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)(圖4)，其產(chǎn)物不再具有顯色能力。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié) 果，優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面，所述染色液的pH為6-8，如pH6、pH6.5、或pH7。染色后，聚丙烯酰胺凝膠無需脫色步驟。因此，優(yōu)選本發(fā)明第一方面所述的方 法不包括脫色步驟。染色后的聚丙烯酰胺凝膠可以倒掉染色溶液后，就直接觀察染色結(jié) 果，也可以洗去其表面殘留的染色液，然后用于觀察結(jié)果。優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面， 所述方法包括在染色后洗滌的步驟。更優(yōu)選本發(fā)明第一方面所述的方法由將聚丙烯酰胺 凝膠浸入pH為5.5-9的含乙基紫的染色液中染色的步驟和在染色后洗滌的步驟組成。在 本文中，“洗滌”指的是用溶劑清洗聚丙烯酰胺凝膠，用以洗去上一步驟殘留在聚丙烯 酰胺凝膠上的試劑。其中，優(yōu)選溶劑是醇、水、生理鹽水或緩沖液，如Tris-HCl緩沖 液、PBS緩沖液等。洗滌的時間不必過長，可以是30秒至5分鐘，優(yōu)選是1分鐘至3分 鐘。優(yōu)選洗滌是先用醇洗然后用水洗。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，先用50%乙醇溶液 沖洗1分鐘，接著用去離子水清洗1分鐘。優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面中，所述染色液中乙基紫的濃度為0.0005 %至 0.0015%,優(yōu)選為0.0006%至0.0012%，最優(yōu)選為0.0008%。本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，EV 濃度過低，則染色后的顏色強(qiáng)度會有下降，而濃度過高，EV會使背景也過多地染上色， 從而降低圖像的對比度。另外，在本文中如未特別指出，所述“溶液”均為水溶液，艮口 溶劑為水，優(yōu)選明示出其中所含的溶質(zhì)為所述溶液中的全部溶質(zhì)；也優(yōu)選對于液體溶質(zhì) 來說，其百分比濃度指的是體積百分比濃度，而對于固體溶質(zhì)來說，其百分比濃度指的 是質(zhì)量百分比濃度。在現(xiàn)有的染色方法中，有機(jī)溶劑常用來作為染色的介質(zhì)或固定劑，用以提高染 色強(qiáng)度，從而提高靈敏度。但是，本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)溶劑并不能對聚丙烯酰胺 凝上的DNA有效提高染色強(qiáng)度。因此出于成本和配制方便的考量，優(yōu)選在本發(fā)明的第一 方面中，所述染色液基本不含有機(jī)溶劑。其中，“基本”表示有機(jī)溶劑的含量小于5%， 優(yōu)選小于1%，更優(yōu)選小于0.1%，更加優(yōu)選小于0.01%，在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中， 除了最初為了快速溶解EV而使用有機(jī)溶劑之外，稀釋時不再添加有機(jī)溶劑。優(yōu)選所述 有機(jī)溶劑選自甲醇、乙醇、甘油和丙二醇之一或多種。在現(xiàn)有的染色方法中，無機(jī)鹽常用來降低凝膠背景上染色的程度。但是，本發(fā) 明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，加入無機(jī)鹽后隨著凝膠背景上染色強(qiáng)度的下降，DNA條帶的染色強(qiáng)度 更劇烈地下降。這可能是由于無機(jī)鹽中的陽離子與EV競爭性地結(jié)合掉了 DNA雙鏈上 磷酸基團(tuán)所帶的負(fù)電荷的緣故。因此，優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面中，所述染色液基本不 含無機(jī)鹽。其中，“基本”表示無機(jī)鹽的濃度小于5mM，優(yōu)選小于ImM，更優(yōu)選小于O.lmM,更加優(yōu)選小于O.OlmM，在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，除了為了調(diào)節(jié)pH加入酸 或堿而可能形成的無機(jī)鹽之外，不再添加無機(jī)鹽。優(yōu)選所述無機(jī)鹽選自NaCl、MgCl2、 ZnCl2和(NH4)2SO4之一或多種。最優(yōu)選，本發(fā)明第一方面所述的方法中所述的染色液是 EV的水溶液，其中溶質(zhì)僅是EV，溶劑僅是水。在本發(fā)明的第一方面中，染色的時間為至少5分鐘。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，染色 的時間可以不必過長。因此出于節(jié)約操作時間的考量，優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面中，染 色的時間優(yōu)選為10至240分鐘，更優(yōu)選為15至45分鐘，最優(yōu)選為20分鐘。在第二方面，本發(fā)明的目的在于提供用于本發(fā)明第一方面所述方法的試劑盒， 其包括分裝的pH為6-8的含乙基紫的染色液。所述試劑盒還可以包括分裝的醇，如50% 乙醇溶液。更優(yōu)選所述試劑盒中染色液中各組分的含量如本發(fā)明第一方面所優(yōu)選的那 樣。盡管不優(yōu)選，但是所述試劑盒還可以包括分裝的水，如去離子水。在本文中，試劑盒具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所能理解的含義，在本文中，其包括分 開的容器，分別包裝(即，分裝)不同的溶液。這樣，不同的溶液之間不會發(fā)生混合。 其中，容器是任何能夠保存其所儲存的溶液的容器，如玻璃瓶、塑料罐等，優(yōu)選是能夠 長期保存其所儲存的溶液的容器。另外，優(yōu)選本發(fā)明第二方面的試劑盒還包括記載有本 發(fā)明第一方面所述方法的說明書。說明書可以是獨(dú)立的，如紙質(zhì)說明書，其被放入試劑 盒中；說明書也可以是直接印刷在試劑盒上的，如可以印刷在試劑盒中的一個或多個容 器上。 在第三方面，本發(fā)明的目的在于提供在聚丙烯酰胺凝膠上檢測DNA的方法，其 包括在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，然后進(jìn)行本發(fā)明第一方面所述的方法。聚丙烯酰胺 凝膠電泳是本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)，其方法步驟及使用的試劑、設(shè)備可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》(科學(xué)出版社，2002)等書籍或?qū)嶒?yàn)手冊，也有許多已經(jīng)商品化了。在第四方面，本發(fā)明的目的在于提供用于本發(fā)明第三方面所述方法的試劑盒， 其包括分裝的聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑和pH為6-8的含乙基紫的染色液。聚丙烯酰胺凝 膠電泳試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，其可以通過商業(yè)渠道容易地購買。所述試劑盒 還可以包括分裝的醇，如50%乙醇溶液。更優(yōu)選所述試劑盒中染色液中各組分的含量如 本發(fā)明第一方面所優(yōu)選的那樣。盡管不優(yōu)選，但是所述試劑盒還可以包括分裝的水，如 去離子水。另外，優(yōu)選本發(fā)明第四方面的試劑盒還包括記載有本發(fā)明第三方面所述方法 的說明書。說明書可以是獨(dú)立的，如紙質(zhì)說明書，其被放入試劑盒中；說明書也可以是 直接印刷在試劑盒上的，如可以印刷在試劑盒中的一個或多個容器上。在第五方面，本發(fā)明的目的在于提供乙基紫在制備用于在聚丙烯酰胺凝膠上對 DNA染色的染色液中的應(yīng)用。本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，EV的分子結(jié)構(gòu)和DNA分子具有很 強(qiáng)的親和力，但是EV分子結(jié)構(gòu)和聚丙烯酰胺結(jié)合的能力則弱得多，從而能夠使DNA(相 對于聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì))顯出顏色。因此，EV作為對聚丙烯酰胺凝膠中DNA染色的 有效成分可以配制入染色液中，從而制備形成用于在聚丙烯酰胺凝膠上對DNA染色的染 色液。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需 要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說明，尤其是權(quán)利要求書和說明書中位于括 號內(nèi)的附圖標(biāo)記僅僅是為了方便閱讀時的理解，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修 正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這 些文獻(xiàn)也是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本發(fā)明進(jìn)行參考，就好像 它們的全文已經(jīng)在本發(fā)明說明書中重復(fù)敘述過一樣。


圖1顯示了 EV的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。圖2顯示了本發(fā)明的EV染色法中以不同EV濃度和不同pH值染色的效果變化曲 線，其中，(A)為以不同的EV濃度染色得到的強(qiáng)度變化；(B)為以不同pH值染色得到 的強(qiáng)度變化。圖中曲線分別針對上樣量為12ng和6ng的泳道中大小為1353bp和1078bp 的DNA條帶。圖3顯示了本發(fā)明的EV染色法與其他2種比較例的方法的染色照片，其中， (A)本發(fā)明的EV染色法，(B)現(xiàn)有的EB染色法，(C)現(xiàn)有的NB染色法。泳道從左至右 上樣的 OX174DNA/HaeIII 分子量標(biāo)記的量分別為(1)200，(2)100，(3)50，(4)25， (5)12.8，(6)6.4，(7)3.2，(8)1.6，(9)0.8，(10)0.4ng。圖4顯示了 EV與OH_反應(yīng)的化學(xué)式。圖5顯示了本發(fā)明的EV染色法與現(xiàn)有的EB染色法的靈敏度比較圖，其中， (A)本發(fā)明的EV染色法，(B)現(xiàn)有的EB染色法。泳道從左至右上樣的IOObp DNA分 子量梯度標(biāo)記的量分別為(1)100，(2)50，(3)25，(4)12.8，(5)6.4，(6)3.2，(7)， 1.6(8)0.8，(9)0.4，(10)0.2ng。
具體實(shí)施例方式以下通過具體的實(shí)施例進(jìn)行說明，其中未特別詳細(xì)說明的材料、步驟均為本領(lǐng) 域技術(shù)人員所熟知的，如可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，2002)等書籍或?qū)?br> 驗(yàn)手冊。1，實(shí)驗(yàn)材料乙基紫(EV)、溴化乙錠(EB)、尼羅藍(lán)(NB)、丙烯酰胺、甲基雙丙烯酰胺 (Bis) >四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(APS)、Tris、和硼酸購自Sigma-Aldrich Chemical Co. (St丄ouis，MO,美國)。ΦΧ174 DNA/HaeIII分子量標(biāo)記(Cat # G1761)購自 Promega Corporation (Madison, WI,美國)；IOObp DNA 分子量梯度標(biāo)記購自 TAKARA
公司(大連，中國)。其他化學(xué)產(chǎn)物均通過市售渠道購買。2，電泳和圖像分析根據(jù)常規(guī)的聚丙烯酰胺電泳法進(jìn)行，簡要過程如下用TBE緩沖液 (89mM TB, 2mM EDTA, pH 8.3)溶解丙烯酰胺并聚合成8 %聚丙烯酰胺凝膠 (80mmX IOOmmX0.75mm),其中，丙烯酰胺與Bis的用量比為29 1。 分子量標(biāo)記 用 Tris-EDTA(TE)緩沖液(IOmM EDTA，IOOmM Tris-Cl, pH 8.0)稀釋成各個濃度并上 樣到凝膠的各個泳道上對于上樣的是OX174DNA/HaeIII分子量標(biāo)記來說，使得每個 泳道的ΦΧ174 DNA/HaeIII分子量標(biāo)記的上樣量分別為200，100，50，25，12.8，6.4， 3.2，1.6，0.8，和0.4ng;對于上樣的是IOObp DNA分子量梯度標(biāo)記來說，使得每個泳道的IOObp DNA分子量梯度標(biāo)記的上樣量分別為100，50，25，12.6，6.4，3.2，1.6，0.8， 0.4，和0.2ng。溴酚藍(lán)和二甲苯胺FF(xylene cyanol FF)作為電泳過程中指示前沿的標(biāo) 記。用 Miniprotean III dual slab cells (BioRad，Hercules, CA,美國)和 PAC 300 (BioRad) 以20mA/凝膠的參數(shù)進(jìn)行電泳，電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部邊緣，一般需要30分鐘。
電泳完成后的凝膠分別用以下染色法進(jìn)行染色并觀察顯色結(jié)果。用EV、NB染 色的凝膠利用掃描儀(Epson Perfection V700 Photo,美國)以600dpi的分辨率掃描成圖 像；用EB染色的凝膠在302nm波長的紫外燈照射下用Molecular Imager Gel Doc XR成 像系統(tǒng)(BioRad)拍成照片(圖像)，然后用計(jì)算機(jī)定量分析DNA條帶的顯色結(jié)果，其中 圖像定量分析軟件為 Multi Gauge software of Science Lab 2006 (FUJIFILM Corporation,日 本)。 3，本發(fā)明的EV染色法的實(shí)施例EV溶解于90%乙醇溶液中配成0.4%的EV溶液。然后，用去離子水將EV溶 液稀釋成不同濃度的EV溶液，最終溶液中EV的濃度分別為0.0001%至0.002%;同時， 將EV溶液通過加入IM HCl或IM NaOH來調(diào)節(jié)成不同的pH值的EV溶液，最終溶液中 pH值分別為3至11;同時，將EV溶液通過加入甲醇、乙醇、甘油、丙二醇來調(diào)節(jié)成含 不同有機(jī)溶劑種類和濃度的EV溶液，使最終溶液中的有機(jī)溶劑的含量分別為0 (最初溶 解EV的90%乙醇溶液可以忽略不計(jì))或5%至40%;同時，將EV溶液通過加入NaCl、 MgCl2> ZnCl2> (NH4)2SO4來調(diào)節(jié)成含不同無機(jī)鹽種類和濃度的EV溶液，使最終溶液 中的無機(jī)鹽濃度分別為OmM (調(diào)節(jié)pH時加入的酸或堿可以忽略不計(jì))至200mM。電泳 后，使用多個聚丙烯酰胺凝膠分別浸入IOOmL各個EV濃度、pH值、有機(jī)溶劑種類和濃 度以及無機(jī)鹽種類和濃度的最終溶液中進(jìn)行染色，染色時間分別為5至240分鐘。然后 用50mL 50%乙醇溶液沖洗1分鐘，接著在IOOmL去離子水中清洗1分鐘。這一系列實(shí)驗(yàn)的結(jié)果比較如下(I)EV的濃度對染色的影響溶液中以0.0002%-0.002% EV的濃度分別進(jìn)行染色，其結(jié)果如圖2A所示，綜 合DNA條帶的檢測靈敏度以及DNA和背景之間的圖像對比度，發(fā)現(xiàn)0.0008 %的EV濃度 是最佳的。盡管濃度低至0.0005%，EV仍舊能對凝膠上的DNA進(jìn)行染色，但是染色后 的顏色強(qiáng)度會有下降，而高于0.001%的EV濃度會使背景也過多地染上色，從而降低圖 像的對比度。(2)溶液的pH值對染色的影響溶液中以pH 3-11分別進(jìn)行染色，其結(jié)果如圖2B所示，綜合DNA條帶的檢測靈 敏度以及DNA和背景之間的圖像對比度，發(fā)現(xiàn)pH6-8是最佳的，在酸性和堿性條件下， 染色效果均會發(fā)生顯著下降。(3)溶液中的有機(jī)溶劑對染色的影響在染色中，甲醇、乙醇、甘油、丙二醇等 有機(jī)溶劑常用來作為染色的介質(zhì)或固 定劑，用以提高染色強(qiáng)度，從而提高靈敏度。但是，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這些有機(jī)溶劑以 5% -40%的濃度并不能對聚丙烯酰胺凝上的DNA有效提高染色強(qiáng)度。(4)溶液中的無機(jī)鹽對染色的影響在染色中，NaCl、MgCl2> ZnCl2> (NH4)2SO4等無機(jī)鹽常用來降低凝膠背景上染色的程度。但是，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)加入無機(jī)鹽后DNA條帶的染色強(qiáng)度更劇烈地下降， 甚至當(dāng)無機(jī)鹽濃度超過IOOmM時，經(jīng)20分鐘的染色都無法檢測到200ng的DNA分子量 標(biāo)記。(5)染色時間對染色的影響用0.0008% EV溶液對 強(qiáng)DNA條帶相對于背景的染色強(qiáng)度，超過20分鐘 后靈敏度基本保持平穩(wěn)，而低于20分鐘則會時間長度依賴性地降低染色強(qiáng)度。4，比較例1 現(xiàn)有的EB染色法根據(jù)Sambrook J等[19]的手冊進(jìn)行染色。基本過程如下電泳后，聚丙烯酰胺 凝膠浸在0.5 μ g/mL的EB溶液中染色15分鐘。5，比較例2 現(xiàn)有的NB染色法根據(jù)Yong-II Yang等[13]的論文進(jìn)行染色。基本過程如下NB溶解于甲醇配 成0.1%的NB溶液，然后用20%乙醇將其稀釋成0.0015% NB溶液。電泳后，聚丙烯酰 胺凝膠浸在IOOmL 0.0015% NB溶液中染色15分鐘。在染色過程中，實(shí)驗(yàn)容器需用鋁箔 包裹以避光。6，結(jié)果比較本發(fā)明的用EV對在聚丙烯酰胺凝膠中的DNA染色的方法能以約20分鐘完成， 其可以檢測到低至0.8ng的ΦΧ174 DNA/HaeIII分子量標(biāo)記，超過現(xiàn)有的EB染色法的4ng 的檢測效果，更遠(yuǎn)超過現(xiàn)有的NB染色法的檢測極限(參見圖3)。如圖5所示，對于比較規(guī)律的DNA樣品(如IOObp DNA分子量梯度標(biāo)記)來 說，本發(fā)明的用EV對在聚丙烯酰胺凝膠中的DNA染色的方法的靈敏度和現(xiàn)有的EB染色 法相似，甚至能超過。參考文獻(xiàn)[l]Aaij, C., Borst, P., Biochim.Biophys.Acta 1972，269，192-200.[2] Sharp, R.A., Sugden, B., Sambrook, J., Biochemistry 1973，12， 3055-3062.[3]Ohta, T.，Tokishita, S.I., Yamagata, H., Mutat.Res.2001，492，91-97.[4]Suenaga, E.，Nakamura, H., Anal.Sci.2005，21，619-623.[5]Tuma, R.S., Beaudet, M.P., Jin, X.，Jones, L.etal.，Anal.Biochem.1999,
268， 278-288.[6]Kantor, G.J., Hull, D.R., Biophys.J.1979, 27，359—370.[7]Cerutti, P.A., Science 1985，227，375-381.[8]Marks, R.，Cancer 1995，75，607-612.[9]Daru, Y.S., Ramesh, K., Methods Cell.Mol.Biol.1989, 1，183-187.[10]Torres, J.S., Noyala, P., Tech.Tips 1993，9，40.[ll]Yang, Y.I., Jung, D.W., Bai, D.G., Yoo, G.S., Choi, J.K., Electrophoresis 2001, 22，855-859.[12]Adkins, S., Burmeister, M.，Anal.Biochem.1996，240，17-23.[13]Yang, Y.I., Hong, H.Y., Lee, I.S., Bai, D.G.etal.，Anal.Biochem.2000，280， 322-324.[14]Smith, Cl.，Biotechnic and Histochemistry. 1966，41，291-294.[15]Moxey, P.C., Yeomans, N.D., J Histochem Cytochem. 1976，24，755-756.[16]Diana, C., Richard, W.H., The Histochemical Journal. 1982, 14，911-928.[17]Choi, J.K., Tak, K.H., Jin, L.T., Hwang, S.Y.et al.，Electrophoresis 2002， 23， 4053-4059.[18]Sambrook, J.，F(xiàn)ritsch, E.F., Maniatis, T.，Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989.
[ 19]Sinden, R.R., DNA Structure and Function, Academic Press, San Diego, CA 1994，pp.109-110.[20]Long, X.F., L, D.S., W, N., Z, C.H.etal.，Spectrochimica Acta Part A 2008， 69， 142-147.
權(quán)利要求
1.在聚丙烯酰胺凝膠上對DNA染色的方法，其特征在于，所述方法包括將聚丙烯酰 胺凝膠浸入pH為5.5-9的含乙基紫的染色液中染色。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其包括在染色后洗滌的步驟。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述染色液中乙基紫的濃度為0.0005%至 0.0015%,優(yōu)選為 0.0006%至 0.0012%，最優(yōu)選為 0.0008%。
4.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述染色液基本不含有機(jī)溶劑，優(yōu)選所述有機(jī)溶 劑選自甲醇、乙醇、甘油和丙二醇之一或多種。
5.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述染色液基本不含無機(jī)鹽，優(yōu)選所述無機(jī)鹽選 自 NaCl、MgCl2> ZnCl2 禾日(NH4)2SO4 之一或多種。
6.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中染色的時間為至少5分鐘，優(yōu)選為10至240分 鐘，更優(yōu)選為15至45分鐘，最優(yōu)選為20分鐘。
7.用于權(quán)利要求1-6之任一所述方法的試劑盒，其包括分裝的pH為6-8的含乙基紫 的染色液。
8.乙基紫在制備用于在聚丙烯酰胺凝膠上對DNA染色的染色液中的應(yīng)用。
9.在聚丙烯酰胺凝膠上檢測DNA的方法，其包括在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，然 后進(jìn)行權(quán)利要求1-6之任一所述方法。
10.用于權(quán)利要求9所述方法的試劑盒，其包括分裝的聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑和pH 為6-8的含乙基紫的染色液。
全文摘要
本發(fā)明涉及乙基紫(EV)在聚丙烯酰胺凝膠上對DNA染色的方法，其中染色液為pH為6-8的含乙基紫的溶液。另外，本發(fā)明還涉及基于上述方法的在聚丙烯酰胺凝膠上檢測DNA的方法以及用于這些方法的試劑盒等。
文檔編號G01N27/447GK102021230SQ200910170880
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月12日
發(fā)明者叢維濤, 馮治國, 張美玲, 朱忠欣, 李校堃, 林紹強(qiáng), 梁廣, 金利泰 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院