本發明大體上涉及測定方法及使用測定方法進行生物測定（例如特異性結合測定）的系統，且更確切地說，用于蛋白質和核酸分析的多重生物測定。免疫測定和分子測定通常需要大動態范圍來進行定量或半定量測定。本發明大體上涉及調節及擴展多重測定板中所有分析物的動態范圍以匹配于檢測器的固有電子動態范圍。

背景技術：

1、多重測定：

2、對包含免疫測定和分子測定的特異性結合測定的不斷增長的需求給診斷行業帶來了壓力，要求通過設計多重測定以同時測試數種分析物來降低成本且使樣本使用最佳化。代替通過常規方法每樣本進行一次測試，可進行許多測試，每樣本產生許多數據點。考慮到在單個測定工作流程中運行相當于20個、100個或更多個不同測定所節省的時間，多重的益處是顯而易見的。舉例來說，使用20個微孔板（每測試使用一個板）來運行20次測試，可減小至1個微孔板，從而顯著節省制造成本。測試量的增加和快速周轉結果的壓力進一步增強了多重測定的價值。在單一測定中測量多個目標的能力使研究人員和實驗室人員能夠在單次運行中檢測數百種分析物且產生數千個測試數據點。雖然審慎地使用寶貴的樣本量，但眾所周知，難以從許多兒科患者身上獲取足夠的血液樣本。從篩選生物標志物進行進一步評估以驗證藥物開發結果，多重測定提供了許多重要益處，有助于節省時間、節省勞動力、節省材料資源、節約有限的樣本量、降低測試成本且最佳化生產力。

3、分析物在樣本中的存在或不存在是通過使樣本與將特異性結合到所需分析物但不與已實踐數十年且本領域中眾所周知的其它分析物特異性結合的試劑接觸來確定的。可通過使用光信號檢測特異性結合對的存在或不存在來確定結合反應的存在或不存在。存在多種多重技術，例如顏色譯碼微珠粒、數字譯碼磁性珠粒、微陣列和多種顏色熒光團。在多重測定中，使用譯碼微粒子來進行分析物識別。通過微陣列中不同珠粒顏色、數字條碼或微點的數目來確定所測量分析物的數目。給定應用領域或技術類別內的多重測定可基于每次測定可測量的分析物數目而進一步分級，其中“多重”是指每次測定具有最高數目的分析物測量值的分析物。“低重（low-plex）”（>?2且<?5）或“中重（mid-plex）”是指處理較少（>?5且<?50）的程序，但沒有基于所測量分析物的數目來呼叫程序多重、中重或低重的正式準則。在生物科學中，多重測定可使用磁性珠粒在單個實驗中同時測量多個分析物。多重免疫測定為特異性結合測定的一種形式，為使用珠粒結合捕捉抗體的elisa的衍生物。在過去幾年中，多重測定已開始從研究應用轉向臨床情境。

4、傳感器動態范圍：

5、許多因素可能影響生物測定的動態范圍，例如光源的功率、樣本量、基質量或基質表面積、粒子或珠粒數目、電子增益因素、光學元件以及光學檢測器的質量和性質。其中，光學檢測器在動態范圍方面發揮著極其顯著的作用。大多數定量生物測試是使用例如ccd、cmos、光倍增管等光學傳感器或檢測器進行的。傳感器芯片為生物測定檢測的關鍵元件，但傳感器的固有動態范圍受到其電子容量的限制。

6、舉例來說，電荷耦合裝置（ccd）為高靈敏度的光子檢測器。傳感器芯片被劃分為許多感光性小區域（稱為像素），其可用于建構所關注場景的圖像。落入由像素中的一個定義的區域內的光的光子將轉換成一個（或多個）電子，且收集到的電子的數目將與每一像素處場景的強度成正比。當傳感器計時（即，運行積分持續時間）時，測量每一像素中的電子的數目且可重建光子的數目。舉例來說，ccd的動態范圍通常定義為滿阱容量除以相機噪聲，且與相機同時記錄極低光信號以及亮信號的能力有關。所述比率通常以分貝表示，其經計算為dr（滿阱容量/讀取噪聲）或數字化信號所需的相等數目個a/d單元。由于所有光學傳感器可在滿阱容量下達到光子飽和，因此傳感器擴展動態范圍的上端的傳感器能力受到限制。同時，電子噪聲限制動態范圍的下端。因為傳感器的電子動態范圍為固定的。樣本中每種分析物的動態范圍（dr）需要落入或能夠匹配于傳感器的dr，以便準確地評估其存在和/或數量。

7、生物測定和多重測定的動態范圍：

8、生物測定（免疫測定和分子特異性結合測定兩者）通常需要大動態范圍來定量具有寬范圍的分析濃度的分析物。針對多重測定，所述需求變得更具挑戰性，其中多個分析物在樣本中可能具有極其不同的濃度范圍。對于單個分析物標靶，樣本稀釋通常為出于檢測目的調節分析濃度的方法，但不可能針對具有顯著不同濃度和/或信號范圍的多個分析物準確地進行調節。多重測定中的每個個別標靶皆需要在其自有恰當動態范圍內進行定量測定，但濃度范圍可能會有顯著差異。

9、生物測定通常需要大動態范圍來定量具有寬范圍的濃度的分析物。對于生物測定，測定的動態范圍被描述為可通過測定可靠地檢測到的分析物的最低至最高濃度。這被稱為檢測下限和上限（分別為llod和ulod）。對于常用的生物測定系統，有用的動態范圍受限于大致2至4個十進位（2對數至4對數）。

10、對于單個標靶的檢測，稀釋常用于調節待由檢測器檢測的樣本中的分析物濃度。在不同臨床條件下，分析物的濃度可在不同樣本間極其不同。具有大動態范圍來覆蓋具有臨床意義的濃度范圍為重要的。盡管樣本稀釋已成為常見做法，但對一個樣本中的多個分析物進行適當稀釋變得極其困難。個別分析物的所關注濃度范圍可廣泛變化，例如，在免疫測定中：分析物1：自0.1?pg/ml至1,000?pg/ml，分析物2：自1.0?pg/ml至10,000?pg/ml，3：自10?pg/ml至100,000?pg/ml等。在核酸、dna、rna分子測定中：分析物濃度可在單個復本至1,000個復本范圍內。后pcr反應的定量可能甚至更加困難，其范圍可為0.001?fmole/ul至1,000?fmole/μl，具有寬動態范圍。如果一種高濃度分析物的樣本被稀釋，那么可能無法檢測其它低濃度分析物。考慮到多重測定中分析物的數目，進行恰當稀釋成為一項艱巨的任務，其中所有樣本的所有分析物皆落入單個傳感器的動態范圍內。

技術實現思路

1、提供一種方法和系統，其對于使用多個光學積分持續時間的多重生物測定中分析物中的兩個或更多個具有可調節及可擴展的動態范圍。取決于分析物，使用短暴露時間以避免傳感器飽和，以便延長濃度的上限。為了延長濃度的下限，使用長暴露時間來產生更多光子且克服讀取噪聲。以此方式，可最佳化及定制用于多重測定中的每一分析物的檢測的動態范圍。

2、本發明涉及增強用于定量測量的生物測定的動態范圍。更重要地，其解決用于多重測定的受限動態范圍問題，其中每一目標分析物具有寬范圍的濃度范圍。由于所有光學傳感器針對動態范圍的上限受到滿阱電子容量限制且針對動態范圍的下端受到電子噪聲限制，因此傳感器動態范圍的界限為固定數目。然而，由傳感器檢測到的光子的量取決于由分析物產生的光子通量的持續時間。在熒光的情況下，總可測量熒光強度為“分析物濃度”和“光強度的持續時間”的乘積。

3、本發明涉及從每次測量的一系列積分持續時間獲得多個信號。使用短積分持續時間產生較少數目的光子，以避免高濃度傳感器飽和；且使用長積分持續時間以產生較多數目的光子，以克服低濃度的檢測器噪聲。因此，針對每一樣本測量利用一系列積分持續時間。

4、在一實施例中，提供一種對樣本中的多個分析物進行測定的方法，其中每一分析物在所述樣本中的存在或不存在通過光信號來指示。方法可包含以下步驟：通過以下來確定分析物的存在：將光源提供到樣本，其中發射與個別分析物的存在相關聯的光信號；通過一個或多個光檢測器在多個持續時間處捕獲各自包含多個分析物的多個圖像；對于多個分析物中的第一分析物，通過一個或多個處理器確定與關聯于第一分析物的存在的光信號相關聯的積分持續時間的第一范圍，通過一個或多個處理器識別多個圖像中的在與關聯于第一分析物的存在的光信號相關聯的積分持續時間的第一范圍內的持續時間處捕獲的第一圖像，以及通過一個或多個處理器分析第一圖像以確定第一分析物的存在；且對于多個分析物中的第二分析物，通過一個或多個處理器確定與第二分析物的存在相關聯的積分持續時間的第二范圍，通過一個或多個處理器識別多個圖像中的在與關聯于第二分析物的存在的光信號相關聯的積分持續時間的第二范圍內的持續時間處捕獲的第二圖像，以及通過一個或多個處理器分析第二圖像以確定第二分析物的存在。

5、在另一實施例中，提供一種對樣本中的多個分析物進行特異性結合測定的方法，其中每一分析物在所述樣本中的存在或不存在通過光信號來指示。方法可包含：為每一分析物提供特異性結合對成份；在分析物將與其特異性結合對成份穩定結合但將不結合到其它特異性結合對成份且穩定結合的特異性結合對能夠通過發射光信號而檢測到的條件下，使樣本與特異性結合對成份接觸；通過以下來確定穩定結合的特異性結合對成份的存在：在一段時間內將光源提供到多個特異性結合對成份和分析物，其中穩定結合的特異性結合對將發射光信號；通過一個或多個光檢測器在多個持續時間處捕獲各自包含多個分析物的多個圖像；對于多個分析物中的第一分析物，通過一個或多個處理器確定與關聯于第一分析物的存在的光信號相關聯的積分持續時間的第一范圍，通過一個或多個處理器識別多個圖像中的在與關聯于第一分析物的存在的光信號相關聯的積分持續時間的第一范圍內的時間處捕獲的第一圖像，以及通過一個或多個處理器分析第一圖像以確定第一分析物的存在；且對于多個分析物中的第二分析物，通過一個或多個處理器確定與第二分析物的存在相關聯的積分持續時間的第二范圍，通過一個或多個處理器識別多個圖像中的在與關聯于第二分析物的存在的光信號相關聯的積分持續時間的第二范圍內的時間處捕獲的第二圖像，以及通過一個或多個處理器分析第二圖像以確定第二分析物的存在。

6、在又一實施例中，提供一種用于檢測與多重生物測定中的分析物的定量測量相關聯的信號的方法，其中測量樣本中的分析物的濃度通過光信號強度來指示。方法可包含：通過光學成像識別多重生物測定中固體基質上的多個分析物中的每一分析物；在所述多重測定中的每一分析物的一系列積分持續時間it-n中的每一個處捕獲多個信號n，其中每一圖像含有用于多重測定中的每一分析物的光信號；對于每一相應分析物，選擇多個光信號中的在所述系列積分持續時間中的處于與相應分析物相關聯的線性范圍內的相應積分持續時間處捕獲的相應光信號；通過基于多個光信號中的其它光信號的積分持續時間與處于與相應分析物相關聯的線性范圍內的相應積分持續時間的比率來補償其它光信號的積分持續時間，正規化所述其它光信號；以及合并正規化光信號以便擴展與多個分析物中的相應分析物相關聯的線性范圍。

7、在再一實施例中，可提供一種具有分析物依賴性動態范圍的系統，其用于測量多重生物測定中的多個分析物中的每一分析物的濃度，所述系統包括：光源，其配置成提供具有不同持續時間的一系列脈沖以激發樣本中的固體基質上的多個分析物；成像檢測器，其配置成捕獲多個光圖像信號（n），所述多個光圖像信號具有與所述光源的脈沖對應的相應多個光學積分持續時間（id-n），其中光圖像中的每一個含有用于多重生物測定中的每一分析物的光信號；一個或多個處理器；及一個或多個存儲器，其存儲指令，所述指令在由一個或多個處理器執行時使得所述一個或多個處理器針對多個分析物中的每一分析物進行以下操作：對于每一相應分析物，選擇多個光信號中的在所述系列積分持續時間中的處于與相應分析物相關聯的線性范圍內的相應積分持續時間處捕獲的相應光信號；通過基于多個光信號中的其它光信號的積分持續時間與處于與相應分析物相關聯的線性范圍內的相應積分持續時間的比率來補償其它光信號的積分持續時間，正規化所述其它光信號；以及合并正規化光信號以便擴展與多個分析物中的相應分析物相關聯的線性范圍。