本發明屬于分子生物學和生物化學領域，更具體地說，屬于肽領域，因其涉及一種包含腺苷酸環化酶（cyaa）和至少一個肺炎球菌表面蛋白a（pspa）片段的重組蛋白。本發明還涉及編碼所述重組蛋白的表達盒、包含所述蛋白或表達盒的免疫原性組合物，以及它們在獲得針對肺炎鏈球菌（ streptococcus?pneumoniae）的廣譜疫苗中的用途。

背景技術：

1、肺炎鏈球菌是一種重要的人類病原體，可引起肺炎、腦膜炎和敗血癥等疾病。2016年，全年齡段肺炎球菌性肺炎病例達2億例，死亡100萬例，其中5歲以下兒童死亡34萬例。結合疫苗（pcv10（gsk）和pcv13（wyeth/pfizer））是對抗肺炎球菌疾病的主要工具。

2、然而，在已知的100種肺炎球菌血清型中，這些疫苗僅對制劑中包含的10或13種血清型提供防護。此外，在接種人群中觀察到由未包含在制劑中的血清型引起的侵襲性疾病增加，降低了疫苗的有效性。最近，兩種新疫苗已獲得許可，分別包含15種（merck?sharp?&dohme?corp）和20種（wyeth/pfizer）蛋白結合莢膜多糖，試圖擴大血清型覆蓋范圍。然而，必須長期監測這些制劑中未包含的血清型引起的疾病最終增加的情況。

3、為解決現有技術問題，本發明提出一種重組蛋白（cyaa-pspa），其包含博德特氏菌屬（ bordetella?species）（尤其是百日咳博德特氏菌（ bordetella?pertussis））的腺苷酸環化酶（cyaa），用于呈遞至少一個肺炎球菌表面蛋白a（pspa）抗原片段。

4、cyaa能夠與免疫系統細胞表面存在的受體結合，增強對相關抗原的免疫應答。含有特定pspa片段的重組cyaa-pspa蛋白可誘導高水平的抗pspa抗體，這些抗體與多種肺炎球菌分離株表面結合，因此表現出獨立于莢膜血清型的反應性。

5、因此，本發明能夠獲得用于開發針對肺炎鏈球菌的廣譜疫苗的重組蛋白。

6、一些現有技術文獻描述了針對肺炎鏈球菌的疫苗開發，包括pspa的某些片段。

7、巴西專利申請no.pi?1003753-5（2010年9月28日提交，2013年1月22日公布，申請人為funda??o?butantan）題為“基于蛋白質抗原與百日咳細胞抗原和滅活毒素組合的協同免疫原性組合物（ composi??es?imunogênicas?sinérgicas?baseadas?em?antígenos?prot éicos?combinados?com?antígeno?celular?pertussis?e?toxinas?inativadas）”，描述了用于預防百日咳和肺炎鏈球菌感染的免疫原性組合物，但未明確使用cyaa毒素。相比之下，本發明提出一種由博德特氏菌屬（尤其是百日咳博德特氏菌）的cyaa組成的重組蛋白，以獲得對不同肺炎球菌分離株提供廣譜防護的疫苗制劑。

8、國際專利申請no.?pct/ie2004/000140（2004年10月24日提交，2005年4月21日以wo2005/035557（a2）公布，申請人為the?provost,?fellows?and?scholars?of?thecollege?of?the?holy?and?undivided?trinity?of?queen?elizabeth,?near?dublin）題為“腺苷酸環化酶在免疫介導疾病的治療和/或預防中的應用（ adenylate?cyclase?in?the? treatment?and/or?prophylaxis?of?immune-medicated?disease）”，涉及cyaa或其衍生物、突變體、片段、變體或肽，可用于治療和/或預防炎癥和/或免疫介導的疾病和/或自身免疫疾病，以獲得針對炎癥性疾病、感染和自身免疫疾病的疫苗制劑。此外，該文獻使用cyaa作為佐劑，抗原與cyaa分子之間沒有物理融合，而本發明中pspa被接插到重組cyaa中。不同的是，本發明提出一種針對肺炎鏈球菌感染的疫苗制劑，其包含能夠針對表達pspa1、pspa2、pspa3、pspa4或pspa5的肺炎球菌感染提供防護的cyaa-pspa蛋白。

9、巴西專利申請no.pi?1013485?a2（2010年3月23日提交，2021年5月4日公布，申請人為institute?of?microbiology?of?the?ascr,?v.v.i,?institute?of?physiology?ofthe?ascr,?v.v.i和institut?pasteur），題為“多肽、多肽衍生物、藥物組合物、多肽衍生物的用途以及蛋白質載體的制備方法（ poliptídeo,?derivado?de?polipeptídeo,?composi? ?o?farmacêutica,?uso?de?um?derivado?de?poliptídeo,?e,?método?para?a?prepara?? o?de?um?vetor?proteináceo）”，描述了源自cyaa的多肽，以毒素或解毒蛋白的形式用于構建蛋白質表達載體，將分子（特別是多肽，尤其是抗原）遞送到細胞（特別是表達cd11b的細胞）中。不同的是，本發明描述了一種針對肺炎鏈球菌感染的疫苗制劑，包含能夠針對表達pspa1、pspa2、pspa3、pspa4或pspa5的肺炎球菌感染提供防護的重組cyaa-pspa蛋白。

10、美國專利申請no.us?2010/285068（2008年6月27日提交，2010年11月11日公布，申請人為universidad?del?pais?vasco）題為“非侵入性細菌內化到真核細胞中的方法（ method?for?the?internalization?of?non-invasive?bacteria?in?eukaryote? cells）”，涉及非侵入性細菌內化到真核細胞中用于治療和/或預防目的；特別是使用cyaa或其功能等效變體作為誘導非侵入性細菌內化到真核細胞中的試劑。此外，在該文獻中，cyaa被添加到細菌中以幫助其內化到細胞中。無論如何，他們沒有顯示任何實驗表明cyaa輔助誘導針對細菌表達的抗原的免疫應答。然而，本發明與上述美國文獻的不同之處在于，它描述了一種針對肺炎鏈球菌感染的特定疫苗制劑，其包含能夠針對表達pspa1、pspa2、pspa3、pspa4或pspa5的肺炎球菌感染提供防護的重組cyaa-pspa蛋白。

11、美國專利申請no.us?2015/320851（2013年3月22日提交，2015年11月12日公布，申請人為osaka?university）題為“包含肺炎球菌表面蛋白a的肺炎球菌疫苗（ pneumococcal? vaccine?containing?pneumococcal?surface?protein?a）”，公開了一種包含肺炎球菌表面蛋白a（pspa）的肺炎球菌疫苗。不同的是，上述美國文獻未提及使用博德特氏菌屬（尤其是百日咳博德特氏菌）的cyaa，因此與本發明不同，本發明提出一種針對肺炎鏈球菌感染的疫苗制劑，其包含重組cyaa-pspa蛋白。

12、巴西專利申請no.br?11?2015?001350?3（2013年7月23日提交，2017年8月1日公布，申請人為genticel）題為“多核苷酸、嵌合多核苷酸、多核苷酸的用途、載體、細胞培養物、cyaa衍生蛋白、嵌合蛋白、組合物以及制備嵌合蛋白的方法（ polinucleotídeo,? polinucleotídeo?quimérico,?uso?do?polinucleotídeo,?vetor,?cultura?de?célula,? proteína?derivada?de?cyaa,?proteína?quimérica,?composi??o,?e,?método?para? produzir?uma?proteína?quimérica）”，公開了一種嵌合蛋白，其包含（a）博德特氏菌cyaa蛋白的n端部分、（b）異源多肽和（c）博德特氏菌cyaa蛋白的c端部分，用于生產抗hpv病毒的疫苗。然而，使用插入cyaa中的hpv?e7抗原針對hpv感染的有效應答主要是細胞應答，而不是對于如本發明提出的基于pspa抗原的抗肺炎鏈球菌疫苗所預期的抗體應答。

13、題為“針對肺炎鏈球菌的蛋白質疫苗的開發：百日咳細胞疫苗佐劑成分的表征和新疫苗組合的分析（ desenvolvimento?de?vacinas?proteicas?contra?streptococcus? pneumoniae:?caracteriza??o?dos?componentes?adjuvantes?da?vacina?celular? pertussis?e?análise?de?novas?combina??es?vacinais）”（2015年于圣保羅發表，作者carolina?salcedo?rivillas）的生物技術博士論文描述了一種由肺炎球菌表面蛋白a（pspa）組成的疫苗制劑，使用百日咳全細胞疫苗或百日咳博德特氏菌蛋白作為佐劑。然而，與本發明不同的是，在該論文中，pspa僅與cyaa組合（混合），產生少量抗pspa抗體，且不能保護抵御肺炎球菌攻擊。在本發明中，pspa片段被遺傳插入cyaa內的特定位點，以制備重組cyaa-pspa融合蛋白。因此，該論文的結果表明，pspa與腺苷酸環化酶毒素的簡單組合誘導中等水平的抗pspa抗體，但未賦予對肺炎鏈球菌感染的顯著防護。不同的是，本發明提出一種針對肺炎鏈球菌感染的疫苗制劑，包含cyaa-pspa重組蛋白。

14、moreno?at等人的題為“用單一pspa片段免疫小鼠誘導能夠介導補體沉積在不同肺炎球菌菌株上并交叉保護的抗體”的文章（發表于clin?vaccine?immunol，2010年1月在線發表）揭示，pspa4和pspa5能夠在體外誘導高度交叉反應性的抗體，這反映在對小鼠的交叉保護中。不同的是，本發明提出一種針對肺炎鏈球菌感染的疫苗制劑，包含cyaa-pspa重組蛋白。

15、因此，盡管已經存在針對肺炎鏈球菌感染的疫苗，但現有技術中沒有動機獲得用于抗肺炎鏈球菌感染廣譜疫苗的重組cyaa-pspa蛋白，如本發明所提出的那樣。

16、因此，基于所引用的現有技術，目前可用的多價結合疫苗由來自不同肺炎球菌血清型的純化莢膜多糖與載體蛋白綴合組成，可誘導兒童對侵襲性疾病和鼻咽定植的防護，但其有效性僅限于制劑中包含的血清型（迄今為止描述的100種血清型中最多20種），且存在疫苗制劑中不存在的血清型可能替代常見感染株的擔憂。

17、因此，開發能夠誘導針對更廣泛范圍肺炎球菌菌株防護的新候選疫苗至關重要。

技術實現思路

1、有利的是，本發明提出能夠誘導高水平抗pspa抗體的重組cyaa-pspa蛋白，這些抗體與表達pspa1、pspa2、pspa3、pspa4和/或pspa5的肺炎球菌菌株反應。

2、重組cyaa-pspa蛋白能夠保護小鼠抵御表達pspa2、pspa4或pspa5的肺炎球菌的侵襲性攻擊，并且cyaa-pspa蛋白誘導的抗體對不同肺炎球菌分離株具有廣譜反應性，表明它們在疫苗組成賦予血清型非依賴性保護方面具有良好潛力。

3、如前所述，本發明將在針對不同肺炎球菌分離株的廣譜保護方面提供顯著優勢。

4、在第一方面，本發明涉及一種重組蛋白，其包含一個或多個肺炎球菌表面蛋白a（pspa）片段和博德特氏菌屬（尤其是百日咳博德特氏菌）的腺苷酸環化酶（cyaa），其中所述片段源自家族1和2的pspa，優選來自1至4進化枝的片段，或其兩種或更多種的組合。

5、在第二方面，本發明涉及一種表達盒，其包含選自seq?id?no:12至18所示核苷酸序列的dna序列及其簡并序列，所述序列編碼seq?id?no:5至11所示的重組蛋白。

6、在第三方面，本發明涉及一種免疫原性組合物，其包含所述重組蛋白或表達盒以及載體，任選地包含藥學上可接受的佐劑。

7、在第四方面，本發明涉及所述重組蛋白、所述表達盒或所述免疫原性組合物在制備用于預防肺炎鏈球菌感染的疫苗中的用途，所述疫苗優選不分血清型地針對不同肺炎球菌分離株提供廣譜保護。

8、在第五方面，本發明涉及一種在有需要的受試者中預防肺炎鏈球菌感染的方法，其中所述方法包括向所述受試者施用根據本發明的免疫原性組合物。