背景技術(shù)：

1、基于抗體的治療劑已成功用于治療多種疾病，包括癌癥。一種日益流行的正在探索中的途徑是工程改造出共銜接兩種不同抗原的單個免疫球蛋白分子。此類銜接兩種不同抗原的替代抗體形式通常被稱為雙特異性抗體。一種針對雙特異性抗體的特定方法是工程改造出銜接cd3的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和銜接與癌細胞相關(guān)或在癌細胞上上調(diào)的抗原(例如enpp3)的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，使得雙特異性抗體重定向cd3+t細胞來破壞癌細胞。

2、然而，隨著時間的推移，til由于抑制性免疫檢查點的上調(diào)而喪失其細胞毒性能力。雖然檢查點阻斷已經(jīng)證明相對于其他治療選項增加了臨床反應(yīng)率，但許多患者仍然不能實現(xiàn)對檢查點阻斷的反應(yīng)。til上的共刺激受體的銜接有可能提供能夠克服免疫檢查點的負向信號的正向信號。激動性共刺激受體抗體的臨床前和臨床研究確實證明了，共刺激受體的激動作用可產(chǎn)生令人印象深刻的抗腫瘤反應(yīng)，從而激活t細胞來攻擊腫瘤細胞。

3、通過特異性地破壞腫瘤細胞、同時最小化外周毒性來增強抗腫瘤活性對于癌癥療法也是重要的。在這種情形中，至關(guān)重要的是，僅在存在靶標腫瘤細胞的情況下，才向t細胞提供共刺激信號。然而，單特異性全長抗體對共刺激受體的激動作用可能無法區(qū)分til對外周t細胞對導(dǎo)致自身免疫毒性的自身抗原反應(yīng)性t細胞。

4、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員3?(enpp3)是一種ii型跨膜糖蛋白，屬于核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族。這些蛋白質(zhì)參與細胞外核苷酸的水解，并且還具有atp酶和atp焦磷酸酶活性。enpp3在多種癌癥中過表達，包括大多數(shù)腎細胞癌和一些肝癌。由于enpp3在多種腫瘤上過表達，它是靶向治療劑開發(fā)的候選物。雖然已經(jīng)嘗試了靶向enpp3的免疫療法，但仍然需要新穎的免疫反應(yīng)增強組合物來治療enpp3相關(guān)癌癥。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本文提供了新穎抗cd28?x抗enpp3抗體以及使用此類抗體來治療enpp3相關(guān)癌癥的方法。主題抗cd28?x抗enpp3抗體能夠與t細胞上的cd28共刺激分子和腫瘤細胞上的enpp3激動性地結(jié)合。因此，此類抗體選擇性地增強腫瘤部位處的抗腫瘤活性，同時最小化外周毒性。本文所提供的主題抗體特別地可與其他抗癌療法聯(lián)合使用，所述其他抗癌療法包括例如用于治療enpp3相關(guān)癌癥的雙特異性抗體。

2、在第一方面，本文提供了一種抗cd28?x抗enpp3異源二聚抗體，所述抗體包含a)第一單體；b)第二單體；以及c)輕鏈。所述第一單體包含：i)單鏈可變片段(scfv)；和ii)第一fc結(jié)構(gòu)域，其中所述scfv使用結(jié)構(gòu)域接頭共價連接至所述第一fc結(jié)構(gòu)域的n端。所述第二單體從n端至c端包含vh1-ch1-鉸鏈-ch2-ch3，其中vh1是第一可變重鏈結(jié)構(gòu)域并且ch2-ch3是第二fc結(jié)構(gòu)域。所述輕鏈從n端至c端包含vl1-cl，其中vl1是第一可變輕鏈結(jié)構(gòu)域并且cl是恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域。所述scfv包含第二vh結(jié)構(gòu)域(vh2)、scfv接頭和第二可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(vl2)。vh1和vl1一起形成第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(abd)，并且vh2和vl2一起形成第二abd。此外，第一abd和第二abd中的一者是cd28結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且第一abd和第二abd中的另一者是外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3?(enpp3)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

3、在一些實施方案中，所述scfv從n端至c端包含vh2-scfv接頭-vl2。在一些實施方案中，所述scfv從n端至c端包含vl2-scfv接頭-vh2。

4、在示例性實施方案中，第一abd是enpp3結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且第二abd是cd28結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，vh1和vl1是圖22中的任何enpp3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的vh和vl或其變體。在一些實施方案中，vh2和vl2選自以下一者：1)圖15、圖18和圖21中的任何cd28結(jié)合結(jié)構(gòu)域的vh和vl或其變體；或2)?(i)圖15或圖16中的vh或其變體；和(ii)圖15或圖17中的vl或其變體。

5、在一些實施方案中，第一fc結(jié)構(gòu)域和第二fc結(jié)構(gòu)域各自是變體fc結(jié)構(gòu)域。

6、在一些實施方案中，第一和第二fc結(jié)構(gòu)域包含一組選自以下異源二聚化變體的異源二聚化偏斜變體：s364k/e357q?:?l368d/k370s；s364k?:?l368d/k370s；s364k?:?l368e/k370s；d401k:?t411e/k360e/q362e；以及t366w?:?t366s/l368a/y407v，其中編號是根據(jù)eu編號。在一些實施方案中，第一和第二fc結(jié)構(gòu)域包含異源二聚化偏斜變體s364k/e357q?:l368d/k370s，其中編號是根據(jù)eu編號。

7、在某些實施方案中，第一和第二fc結(jié)構(gòu)域各自包含一個或多個消融變體。在示例性實施方案中，所述一個或多個消融變體包含e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，其中編號是根據(jù)eu編號。

8、在一些實施方案中，第一或第二單體中的一者還包含一個或多個pi變體。在一些實施方案中，所述第二單體的ch1-鉸鏈-ch2-ch3包含pi變體n208d/q295e/n384d/q418e/n421d，其中編號是根據(jù)eu編號。

9、在一些實施方案中，所述第二單體的ch1-鉸鏈-ch2-ch3包含氨基酸變體e233p/l234v/l235a/g236del/s267k/l368d/k370s/n208d/q295e/n384d/q418e/n421d，第一fc結(jié)構(gòu)域包含氨基酸變體e233p/l234v/l235a/g236del/s267k/s364k/e357q，其中編號是根據(jù)eu編號。在示例性實施方案中，第一和第二變體fc結(jié)構(gòu)域各自還包含氨基酸變體428l/434s。

10、在一些實施方案中，所述scfv接頭是gkpgsgkpgsgkpgsgkpgs。

11、另一方面，本文提供了一種抗cd28?x抗enpp3異源二聚抗體，所述抗體包含a)第一單體；b)第二單體；c)第一輕鏈；以及d)第二輕鏈。所述第一單體從n端至c端包含vh1-ch1-第一結(jié)構(gòu)域接頭-scfv-第二結(jié)構(gòu)域接頭-ch2-ch3，其中vh1是第一可變重鏈結(jié)構(gòu)域，并且ch2-ch3是第一fc結(jié)構(gòu)域。所述第二單體從n端至c端包含vh1-ch1-鉸鏈-ch2-ch3，其中ch2-ch3是第二fc結(jié)構(gòu)域。所述第一和第二輕鏈各自從n端至c端包含vl1-cl，其中vl1是第一可變輕鏈結(jié)構(gòu)域并且cl是恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域。所述scfv包含第二vh結(jié)構(gòu)域(vh2)、scfv接頭和第二可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(vl2)。所述第一單體的vh1與所述第一輕鏈的vl1以及所述第二單體的vh1與所述第二輕鏈的vl1各自形成第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(abd)，并且所述vh2與所述vl2形成第二abd。此外，第一abd是外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3?(enpp3)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且第二abd是cd28結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或者第一abd是cd28結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且第二abd是enpp3結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

12、在一些實施方案中，所述scfv從n端至c端包含vh2-scfv接頭-vl2。在一些實施方案中，所述scfv從n端至c端包含vl2-scfv接頭-vh2。

13、在示例性實施方案中，第一abd是enpp3結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且第二abd是cd28結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，vh1和vl1選自以下一者：1)圖22中的任何enpp3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的vh和vl或其變體。在一些實施方案中，vh2和vl2選自以下一者：1)圖15、圖18和圖21中的任何cd28結(jié)合結(jié)構(gòu)域的vh和vl或其變體；或2)?(i)圖15或圖16中的vh或其變體；和(ii)圖15或圖17中的vl或其變體。

14、在一些實施方案中，第一fc結(jié)構(gòu)域和第二fc結(jié)構(gòu)域各自是變體fc結(jié)構(gòu)域。

15、在一些實施方案中，第一和第二fc結(jié)構(gòu)域包含一組選自以下異源二聚化變體的異源二聚化偏斜變體：s364k/e357q?:?l368d/k370s；s364k?:?l368d/k370s；s364k?:?l368e/k370s；d401k:?t411e/k360e/q362e；以及t366w?:?t366s/l368a/y407v，其中編號是根據(jù)eu編號。在一些實施方案中，第一和第二fc結(jié)構(gòu)域包含異源二聚化偏斜變體s364k/e357q?:l368d/k370s，其中編號是根據(jù)eu編號

16、在某些實施方案中，第一和第二fc結(jié)構(gòu)域各自包含一個或多個消融變體。在示例性實施方案中，所述一個或多個消融變體包含e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，其中編號是根據(jù)eu編號。

17、在一些實施方案中，第一或第二單體中的一者還包含一個或多個pi變體。在一些實施方案中，所述第二單體的ch1-鉸鏈-ch2-ch3包含pi變體n208d/q295e/n384d/q418e/n421d，其中編號是根據(jù)eu編號。

18、在一些實施方案中，所述第二單體的ch1-鉸鏈-ch2-ch3包含氨基酸變體e233p/l234v/l235a/g236del/s267k/l368d/k370s/n208d/q295e/n384d/q418e/n421d，第一fc結(jié)構(gòu)域包含氨基酸變體e233p/l234v/l235a/g236del/s267k/s364k/e357q，其中編號是根據(jù)eu編號。在示例性實施方案中，第一和第二變體fc結(jié)構(gòu)域各自還包含氨基酸變體428l/434s。

19、在一些實施方案中，所述scfv接頭是gkpgsgkpgsgkpgsgkpgs。

20、另一方面，本文提供了一種抗cd28?x抗enpp3異源二聚抗體，所述抗體包含a)第一單體；b)第二單體；c)第一輕鏈；以及d)第二輕鏈。所述第一單體從n端至c端包含vh1-ch1-鉸鏈-ch2-ch3-結(jié)構(gòu)域接頭-scfv，其中vh1是第一可變重鏈結(jié)構(gòu)域，并且ch2-ch3是第一fc結(jié)構(gòu)域。所述第二單體從n端至c端包含vh1-ch1-鉸鏈-ch2-ch3，其中vh1是第一可變重鏈結(jié)構(gòu)域并且ch2-ch3是第二fc結(jié)構(gòu)域。所述第一和第二輕鏈各自從n端至c端包含vl1-cl，其中vl1是第一可變輕鏈結(jié)構(gòu)域并且cl是恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域。所述scfv包含第二vh結(jié)構(gòu)域(vh2)、scfv接頭和第二可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(vl2)。所述第一單體的vh1與所述第一輕鏈的vl1以及所述第二單體的vh1與所述第二輕鏈的vl1各自形成第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(abd)，并且所述vh2與所述vl2形成第二abd。此外，第一abd是外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3?(enpp3)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且第二abd是cd28結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或者第一abd是cd28結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且第二abd是enpp3結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

21、在一些實施方案中，所述scfv從n端至c端包含vh2-scfv接頭-vl2。在一些實施方案中，所述scfv從n端至c端包含vl2-scfv接頭-vh2。

22、在示例性實施方案中，第一abd是enpp3結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且第二abd是cd28結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，vh1和vl1選自以下一者：1)圖22中的任何enpp3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的vh和vl或其變體。在一些實施方案中，vh2和vl2選自以下一者：1)圖15、圖18和圖21中的任何cd28結(jié)合結(jié)構(gòu)域的vh和vl或其變體；或2)?(i)圖15或圖16中的vh或其變體；和(ii)圖15或圖17中的vl或其變體。

23、在一些實施方案中，第一fc結(jié)構(gòu)域和第二fc結(jié)構(gòu)域各自是變體fc結(jié)構(gòu)域。

24、在一些實施方案中，第一和第二fc結(jié)構(gòu)域包含一組選自以下異源二聚化變體的異源二聚化偏斜變體：s364k/e357q?:?l368d/k370s；s364k?:?l368d/k370s；s364k?:?l368e/k370s；d401k:?t411e/k360e/q362e；以及t366w?:?t366s/l368a/y407v，其中編號是根據(jù)eu編號。在一些實施方案中，第一和第二fc結(jié)構(gòu)域包含異源二聚化偏斜變體s364k/e357q?:l368d/k370s，其中編號是根據(jù)eu編號。

25、在某些實施方案中，第一和第二fc結(jié)構(gòu)域各自包含一個或多個消融變體。在示例性實施方案中，所述一個或多個消融變體包含e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，其中編號是根據(jù)eu編號。

26、在一些實施方案中，第一或第二單體中的一者還包含一個或多個pi變體。在一些實施方案中，所述第二單體的ch1-鉸鏈-ch2-ch3包含pi變體n208d/q295e/n384d/q418e/n421d，其中編號是根據(jù)eu編號。

27、在一些實施方案中，所述第二單體的ch1-鉸鏈-ch2-ch3包含氨基酸變體e233p/l234v/l235a/g236del/s267k/l368d/k370s/n208d/q295e/n384d/q418e/n421d，第一fc結(jié)構(gòu)域包含氨基酸變體e233p/l234v/l235a/g236del/s267k/s364k/e357q，其中編號是根據(jù)eu編號。在示例性實施方案中，第一和第二變體fc結(jié)構(gòu)域各自還包含氨基酸變體428l/434s。

28、在一些實施方案中，所述scfv接頭是gkpgsgkpgsgkpgsgkpgs。

29、另一方面，本文提供了一種異源二聚抗體，所述抗體包含a)第一單體；b)第二單體；c)第一輕鏈；以及d)第二輕鏈。所述第一單體從n端至c端包含vh1-ch1-結(jié)構(gòu)域接頭-vh1-ch1-鉸鏈-ch2-ch3，其中每個vh1均是第一可變重鏈結(jié)構(gòu)域，并且ch2-ch3是第一fc結(jié)構(gòu)域。所述第二單體從n端至c端包含scfv-結(jié)構(gòu)域接頭-ch2-ch3，其中vh1是第一可變重鏈結(jié)構(gòu)域并且ch2-ch3是第二fc結(jié)構(gòu)域。所述第一和第二輕鏈各自從n端至c端包含vl1-cl，其中vl1是第一可變輕鏈結(jié)構(gòu)域并且cl是恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域。所述scfv包含第二vh結(jié)構(gòu)域(vh2)、scfv接頭和第二可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(vl2)。所述第一單體的vh1與所述第一輕鏈的vl1以及所述第二單體的vh1與所述第二輕鏈的vl1各自形成第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(abd)，并且所述vh2與所述vl2形成第二abd。此外，第一abd是外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3(enpp3)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且第二abd是cd28結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或者第一abd是cd28結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且第二abd是enpp3結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

30、在一些實施方案中，第一和第二fc結(jié)構(gòu)域包含一組選自以下異源二聚化變體的異源二聚化偏斜變體：s364k/e357q?:?l368d/k370s；s364k?:?l368d/k370s；s364k?:?l368e/k370s；d401k:?t411e/k360e/q362e；以及t366w?:?t366s/l368a/y407v，其中編號是根據(jù)eu編號。在一些實施方案中，第一和第二fc結(jié)構(gòu)域包含異源二聚化偏斜變體s364k/e357q?:l368d/k370s，其中編號是根據(jù)eu編號。

31、在某些實施方案中，第一和第二fc結(jié)構(gòu)域各自包含一個或多個消融變體。在示例性實施方案中，所述一個或多個消融變體包含e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，其中編號是根據(jù)eu編號。

32、在一些實施方案中，第一或第二單體中的一者還包含一個或多個pi變體。在一些實施方案中，所述第二單體的ch1-鉸鏈-ch2-ch3包含pi變體n208d/q295e/n384d/q418e/n421d，其中編號是根據(jù)eu編號。

33、在一些實施方案中，所述第二單體的ch1-鉸鏈-ch2-ch3包含氨基酸變體e233p/l234v/l235a/g236del/s267k/l368d/k370s/n208d/q295e/n384d/q418e/n421d，第一fc結(jié)構(gòu)域包含氨基酸變體e233p/l234v/l235a/g236del/s267k/s364k/e357q，其中編號是根據(jù)eu編號。在示例性實施方案中，第一和第二變體fc結(jié)構(gòu)域各自還包含氨基酸變體428l/434s。

34、在一些實施方案中，所述scfv接頭是gkpgsgkpgsgkpgsgkpgs。

35、另一方面，本文提供了一種雙特異性抗體，所述雙特異性抗體包含：a)?enpp3結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含i)第一可變重鏈結(jié)構(gòu)域(vh1)，和ii)第一可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(vl1)；和b)抗cd28結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含i)第二可變重鏈結(jié)構(gòu)域(vh2)，和ii)第二可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(vl2)。在一些實施方案中，vh1和vl1選自以下一者：1)圖22中的任何enpp3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的vh和vl或其變體。在一些實施方案中，vh2和vl2選自以下一者：1)圖15、圖18和圖21中的任何cd28結(jié)合結(jié)構(gòu)域的vh和vl或其變體；或2)?(i)圖15或圖16中的vh或其變體；和(ii)圖15或圖17中的vl或其變體。

36、在所述雙特異性抗體的一些實施方案中，第一fc結(jié)構(gòu)域和第二fc結(jié)構(gòu)域各自是變體fc結(jié)構(gòu)域。

37、在所述雙特異性抗體的一些實施方案中，第一和第二fc結(jié)構(gòu)域包含一組選自以下異源二聚化變體的異源二聚化偏斜變體：s364k/e357q?:?l368d/k370s；s364k?:?l368d/k370s；s364k?:?l368e/k370s；d401k:?t411e/k360e/q362e；以及t366w?:?t366s/l368a/y407v，其中編號是根據(jù)eu編號。在一些實施方案中，第一和第二fc結(jié)構(gòu)域包含異源二聚化偏斜變體s364k/e357q?:?l368d/k370s，其中編號是根據(jù)eu編號。

38、在某些實施方案中，第一和第二fc結(jié)構(gòu)域各自包含一個或多個消融變體。在示例性實施方案中，所述一個或多個消融變體包含e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，其中編號是根據(jù)eu編號。

39、在一些實施方案中，第一或第二單體中的一者還包含一個或多個pi變體。在一些實施方案中，所述第二單體的ch1-鉸鏈-ch2-ch3包含pi變體n208d/q295e/n384d/q418e/n421d，其中編號是根據(jù)eu編號。

40、本文還提供了包含編碼本文所述的抗體的核酸的核酸組合物，包括此類核酸的表達載體組合物，用于制備所述抗體的包含所述表達載體組合物的宿主細胞，以及制備所述抗體的方法。

41、另一方面，本文提供了一種治療有需要的患者的enpp3相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括向所述患者施用如本文所述的抗cd28?x抗enpp3雙特異性抗體。

42、另一方面，本文提供了一種治療有需要的患者的enpp3相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括向所述患者施用如本文所述的抗cd28?x抗enpp3雙特異性抗體；和抗cd3?x抗enpp3雙特異性抗體。