本發明涉及蛋白質前藥構建體，例如蛋白質融合構建體，其包括含補體3和妊娠區帶蛋白樣α-2-巨球蛋白結構域(cpamd)蛋白(例如，α-2-巨球蛋白(a2m))和一種或多種藥物，并作為蛋白酶可激活前藥發揮作用。本發明進一步涉及cpamd蛋白的釋放機制和多特異性藥物(如雙特異性藥物)的開發。發明背景當生物制藥藥物以最初活性的形式施用于患者時，它可以在患病和健康組織中發揮其生物學作用。藥物作用于健康組織可能對患者健康、生活質量和/或治療功效有害。使這些副作用最小化的一種策略是將藥物衍生成最初無活性并且在患病環境中變得有活性的前藥形式。蛋白酶是催化其他蛋白質中肽鍵水解的酶。存在超過600種已知的人類蛋白酶，并且大多數在正常情況下受到嚴格調控。在許多疾病中，特異性蛋白酶變得失調并且相對于健康狀況具有增加的活性。已經開發了用于生物制藥藥物的許多蛋白酶活化前藥技術，其中大多數是基于抗體的技術。幾種技術利用阻斷抗體的抗原結合區(抗體結合部位)的掩蔽部分，防止所述抗體與其在靶抗原上的同源表位結合，從而使所述抗體失活。掩蔽部分通過摻入蛋白酶切割位點的連接子與抗體連接。通過蛋白酶切割連接子將抗體與掩蔽部分分離，釋放抗體結合部位并恢復抗體的活性。掩蔽部分可以被設計成特異性結合抗體結合部位(例如，使用噬菌體展示衍生肽，如cytomx的probody技術)，或者可以在空間上充分包裹抗體結合部位以在不具有任何特異性相互作用的情況下隔離所述抗體結合部位(例如，使用長而大的肽，如amunix的xpat技術)。另一種方法通過摻入無活性vh和vl結構域來防止前藥中的功能性vh/vl結構域配對，所述無活性vh和vl結構域通過蛋白酶敏感性連接子連接到抗體上(例如maverick的cobra技術)。連接子的切割除去了無活性結構域并實現了活化前藥中的正確vh/vl配對。這些不同的前藥技術都具有各自的優點和缺點。例如，cytomx的probody最大限度減少了非人類和潛在免疫原性序列的使用，但該技術不是模塊化的，并且需要鑒定摻入平臺中的每種抗體的高親和力掩蔽部分。amunix的xpat平臺不需要特異性的掩蔽/抗體相互作用，而且在前藥活化之前和之后具有循環半衰期的差異，但是這是通過使用長的非人類肽來實現的。因此，需要結合多種技術的關鍵優點的新前藥技術，并且該技術將構成本領域的有意義的進步。在共同待審專利申請pct/ep2023/052280中，描述了使用cpamd和抗體或其他生物藥物制備前藥的新技術。此類基于cpamd的前藥最終是大的(>?700?kda)、單特異性的且四價的。在癌癥的治療中，治療性分子滲透到腫瘤中可以受到其尺寸的限制。此外，一些治療方法，例如t細胞重定向(例如使用雙特異性t細胞銜接器，亦稱bite)需要使用雙特異性抗體，其必須另外地以單價形式與t細胞結合。因此，需要開發能夠以較小尺寸釋放的前藥，和/或釋放的藥物是雙特異性的可能性。

背景技術：

技術實現思路

1、特別地，本文所述的蛋白質前藥構建體(例如，蛋白質融合構建體)能夠實現特異性藥物遞送和可控的活性。這可以通過使蛋白質前藥構建體經歷構象變化來實現，通過所述構象變化，能夠控制包含在所述蛋白質前藥構建體中的一種或多種藥物(例如，第一藥物，如抗體)的活性。在蛋白質前藥構建體的天然(未切割)狀態下，一種或多種藥物(例如，第一藥物/抗體)未被暴露，并且因此是無活性的。在蛋白質前藥構建體的活性(切割)狀態下，藥物(例如，第一藥物/抗體)被暴露并且能夠與其靶標相互作用。例如，第一藥物可以位于包含在本發明的蛋白質前藥構建體中的cpamd蛋白(例如，a2m)的受體結合結構域(rbd)內。cpamd蛋白(例如a2m)包括含有第一蛋白酶切割位點的誘餌區域。從天然狀態到活性狀態的構象變化由誘餌區域中第一蛋白酶切割位點的切割觸發。

2、通常，本文所述的蛋白質前藥構建體包含第二藥物(例如，第二抗體)。第二藥物可以與rbd的c末端融合。在c末端，第二藥物(例如，第二抗體或其他抗原靶向部分)在天然狀態以及活性狀態下是可及的，并且可用于將蛋白質前藥構建體導向特定組織、特定細胞類型和/或特定受體。

3、特異性藥物遞送和可控活性通過藥物(例如，第一抗體和第二抗體)從較大的前藥構建體的釋放機制提供。例如，rbd可以包含在rbd的n末端處的第二蛋白酶切割位點。釋放機制能夠通過第二蛋白酶切割位點的切割實現。通常，rbd在第二蛋白酶切割位點切割后通過非共價相互作用與cpamd蛋白(例如，a2m)保持結合。在第一蛋白酶切割位點的蛋白水解切割之后改變構象時，包含藥物(例如，第一抗體和第二抗體)的rbd從前藥構建體釋放。

4、包含在蛋白質前藥構建體內的切割位點可以被修飾以控制藥物暴露的位置。依賴于切割位點，藥物僅在存在識別切割位點的蛋白酶的位置被暴露。當特異性蛋白酶存在并切割第一切割位點時，蛋白質前藥構建體的構象從“天然的”改變為“活性的”。因此，本發明提供了蛋白質前藥構建體(例如，蛋白質融合構建體)，其中活性和特異性可被控制并定向需要用此類構建體治療的對象的特定區域(例如，特定組織)。

5、在本公開中，本發明人描述了示例性的基于cpamd的前藥，其在cpamd蛋白(a2m)的序列中摻入了第二蛋白酶切割位點，允許攜帶第一藥物的部分在活化后從cpamd蛋白的剩余部分釋放，導致較小的活化第一藥物和單價特異性(實施例12和13)。本發明人進一步描述了cpamd蛋白(a2m)與第一藥物(第一抗體)和第二藥物(第二抗體)同時融合以產生雙特異性前藥，其中第一藥物在釋放之前被cpamd蛋白屏蔽(實施例14)。本發明人還證明包含第一藥物和第二藥物(即第一抗體和第二抗體)的較小的活化和多特異性(即雙特異性)?rbd的釋放(實施例14)。

6、具體地，在一方面，本發明涉及蛋白質前藥構建體，其包括含補體3和妊娠區帶蛋白樣α-2-巨球蛋白結構域(cpamd)蛋白(如a2m)，所述cpamd蛋白包含誘餌區域和受體結合結構域(rbd)，所述誘餌區域包含第一蛋白酶切割位點，并且所述受體結合結構域包含位于rbd的n末端處的第二蛋白酶切割位點、位于rbd內部的第一藥物和與rbd的c末端融合的第二藥物，其中所述cpamd蛋白屏蔽第一藥物，并且第二藥物是可及的，并且cpamd蛋白能夠在第一蛋白酶切割位點的蛋白水解切割后改變構象，釋放rbd，從而使第一種藥物可及。

7、本發明人已經發現rbd在第二蛋白酶切割位點切割后通過非共價相互作用與cpamd蛋白保持結合。因此，在另一方面，本發明涉及蛋白質前藥構建體，其包含含補體3和妊娠區帶蛋白樣α-2-巨球蛋白結構域(cpamd)蛋白(如a2m)，所述cpamd蛋白包含誘餌區域和受體結合結構域(rbd)，所述誘餌區域包含第一蛋白酶切割位點，所述受體結合結構域(rbd)包含位于rbd內部的第一藥物和與rbd的c末端融合的第二藥物，其中所述cpamd蛋白屏蔽第一藥物，并且第二藥物是可及的，所述rbd通過非共價相互作用與所述cpamd蛋白結合，并且所述cpamd蛋白能夠在第一蛋白酶切割位點的蛋白水解切割后改變構象，從而釋放rbd并使第一藥物可及。

8、還提供了編碼本文所述的蛋白質前藥的核酸和包含該核酸的載體，如質粒。因此，這些核酸和載體可以包含在宿主細胞中，并因此另一方面涉及包含上文所述的核酸或上文所述的載體的宿主細胞。還提供了這些方面的若干種生產方法、治療方法和治療用途。