本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，特別涉及特異性結(jié)合her2來源肽段的t細胞受體及其用途。

背景技術(shù)：

1、人類表皮生長因子受體2（human?epidermal?growth?factor?receptor?2，her2）是一類跨膜受體酪氨酸激酶，廣泛表達于多種實體瘤中，包括乳腺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌等。大量研究表明，her2的過度表達或基因擴增與腫瘤細胞的高侵襲性、快速增殖及不良預(yù)后密切相關(guān)，因此her2長期以來被視為腫瘤治療的重要靶點。現(xiàn)有針對her2的治療手段主要包括單克隆抗體、抗體偶聯(lián)藥物（antibody-drug?conjugates，adc）、酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine?kinase?inhibitors，tkis）等，這些策略在部分患者中取得了一定療效，但仍存在耐藥發(fā)生率高、療效持續(xù)性不足、適用人群受限以及毒副反應(yīng)顯著等問題。

2、隨著腫瘤免疫治療的發(fā)展，基于t細胞的靶向療法成為重要研究方向。相比抗體類治療，t細胞受體（t?cell?receptor，tcr）能夠識別由主要組織相容性復(fù)合體（majorhistocompatibility?complex，mhc）分子呈遞的細胞內(nèi)抗原肽，理論上可覆蓋更廣泛的腫瘤相關(guān)抗原形式。然而，天然存在的針對腫瘤抗原的tcr多數(shù)親和力有限，難以在治療中產(chǎn)生足夠的抗腫瘤活性。此外，腫瘤細胞對抗原呈遞的調(diào)控復(fù)雜多變，不同腫瘤類型及其進展階段中，特定her2衍生肽段的呈遞頻率與穩(wěn)定性也存在差別。這些因素均限制了抗her2tcr療法的臨床應(yīng)用。

3、近年來，針對特定her2衍生肽段的高親和力、特異性tcr的發(fā)現(xiàn)與工程化改造成為研究熱點，通過篩選、體外親和力優(yōu)化、結(jié)構(gòu)導(dǎo)向改造等方式，可以獲得能夠穩(wěn)定識別her2肽-mhc復(fù)合物的tcr分子。利用此類tcr修飾自體或異體t細胞，有望實現(xiàn)對her2陽性腫瘤細胞的精確識別與殺傷，克服傳統(tǒng)抗體療法難以覆蓋細胞內(nèi)抗原的局限。

4、然而，目前公開的針對her2特定肽段的tcr種類有限，多數(shù)親和力不足、交叉反應(yīng)性風(fēng)險不明或體內(nèi)效應(yīng)不穩(wěn)定，無法滿足臨床應(yīng)用需求。因此，仍需開發(fā)新的且對her2肽具有高特異性和高親和力，并能在復(fù)雜腫瘤微環(huán)境背景下保持穩(wěn)健抗原識別能力的tcr分子，并進一步用于構(gòu)建tcr-t細胞或其他免疫細胞治療產(chǎn)品，以提升her2陽性惡性腫瘤患者的治療效果。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是目前針對her2的細胞治療產(chǎn)品選擇不多并且效果欠佳，患者需要更多更有效的產(chǎn)品以滿足其多樣化的臨床需求。

2、第一方面，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合her2來源肽段的t細胞受體（tcr），her2來源肽段的序列為kifgslafl（seq?id?no:25），并且t細胞受體包含tcrα鏈可變區(qū)和tcrβ鏈可變區(qū)，其中，tcrα鏈可變區(qū)包含：

3、序列為dsaiyn（seq?id?no:1）的cdr1α；

4、序列為iqssqre（seq?id?no:2）的cdr2α；和

5、序列為apdndykls（seq?id?no:3）的cdr3α，

6、其中，tcrβ鏈可變區(qū)包含：

7、序列為dfqatt（seq?id?no:4）的cdr1β；

8、序列為snegska（seq?id?no:5）的cdr2β；和

9、序列為sasllgvsgrasneqf（seq?id?no:6）的cdr3β。

10、在一些實施方案中，t細胞受體是可溶的。

11、在一些實施方案中，t細胞受體與可檢測標記、治療劑結(jié)合。

12、在一些實施方案中，t細胞受體被peg化。

13、在一些實施方案中，t細胞受體的α鏈恒定區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間設(shè)置有工程化二硫鍵。

14、在一些實施方案中，tcrα鏈可變區(qū)的序列為：

15、kqevtqipaalsvpegenlvlncsftdsaiynlqwfrqdpgkgltsllliqssqreqtsgrlnasldkssgrstlyiaasqpgdsatylcapdndyklsfgagttvtvran（seq?id?no:19），

16、tcrβ鏈可變區(qū)的序列為：

17、gavvsqhpswvicksgtsvkiecrsldfqattmfwyrqfpkqslmlmatsnegskatyeqgvekdkflinhasltlstltvtsahpedssfyicsasllgvsgrasneqffgpgtrltvle（seq?id?no:20）。

18、在一些實施方案中，t細胞受體為融合蛋白。

19、第二方面，本發(fā)明提供了合成的核酸分子，合成的核酸分子編碼本發(fā)明第一方面的t細胞受體。

20、第三方面，本發(fā)明提供了載體，載體包含本發(fā)明的合成的核酸分子。

21、第四方面，本發(fā)明提供了宿主細胞，宿主細胞中包含本發(fā)明的載體。

22、在一些實施方案中，本發(fā)明還提供了宿主細胞，宿主細胞的染色體中整合有本發(fā)明的合成的核酸分子。

23、第五方面，本發(fā)明提供了一種制備t細胞受體的方法，包括：

24、(i)培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞，以表達本發(fā)明第一方面的t細胞受體；以及

25、(ii)分離出t細胞受體。

26、第六方面，本發(fā)明提供了用于腫瘤免疫治療的伴隨診斷試劑盒，包括：t細胞受體蛋白，t細胞受體蛋白包含tcrα鏈可變區(qū)和tcrβ鏈可變區(qū)，tcrα鏈可變區(qū)包含：

27、序列為dsaiyn（seq?id?no:1）的cdr1α；

28、序列為iqssqre（seq?id?no:2）的cdr2α；和

29、序列為apdndykls（seq?id?no:3）的cdr3α，

30、其中，tcrβ鏈可變區(qū)包含：

31、序列為dfqatt（seq?id?no:4）的cdr1β；

32、序列為snegska（seq?id?no:5）的cdr2β；和

33、序列為sasllgvsgrasneqf（seq?id?no:6）的cdr3β，

34、t細胞受體靶向衍生自her2基因(例如：her2)的腫瘤抗原肽，腫瘤抗原肽的序列為：kifgslafl。

35、在一些實施方案中，試劑盒中還包括顯色系統(tǒng)、陽性對照、陰性對照、染色緩沖液、封閉液。

36、在一些實施方案中，伴隨診斷試劑盒的樣本包括：組織樣本、外周血。

37、在一些實施方案中，用于診斷目的的可檢測標記包括例如熒光標記、放射性標記、酶、核酸探針和造影劑。

38、在一些實施方案中，伴隨診斷試劑盒包括：免疫熒光染色（ihc）試劑盒或流式細胞術(shù)檢測試劑盒。

39、在一些實施方案中，伴隨診斷試劑盒的使用方法包括：

40、1）使用tcr-fc蛋白探針對腫瘤組織切片染色；

41、2）檢測是否存在her2/hla復(fù)合物；

42、3）根據(jù)檢測結(jié)果評估her2抗原呈遞能力。

43、在一些實施方案中，伴隨診斷試劑盒的使用方法包括：

44、1）將tcr蛋白探針用于流式染色；

45、2）檢測細胞表面是否表達her2/hla復(fù)合物；

46、3）通過評估抗原呈遞水平或her2表達進行動態(tài)免疫監(jiān)測。

47、第七方面，本發(fā)明提供了一種組合物，包含融合多肽，融合多肽包含前述tcrα鏈和/或tcrβ鏈。

48、在一些實施方案中，通過引入編碼多肽的分離的核酸分子對細胞進行遺傳修飾（genetically?modified，基因修飾），多肽包含前述tcrα鏈和tcrβ鏈中的至少一種。

49、在一些實施方案中，細胞為免疫細胞。

50、在一些實施方案中，免疫細胞選自由下述組成的組：抗原呈遞細胞、b細胞、樹突細胞、巨噬細胞、朗格漢斯細胞（langerhans?cell）、t細胞、nk細胞、nk?t細胞。

51、第八方面，本發(fā)明提供了前述的t細胞受體或合成的核酸分子或載體或宿主細胞在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。

52、在一些實施方案中，藥物可適于通過任何合適的途徑施用，優(yōu)選腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)或優(yōu)選靜脈內(nèi))途徑。

53、第九方面，本發(fā)明還提供了一種治療患者的癌癥的方法，包括向患者施用本發(fā)明的t細胞受體、合成的核酸分子、載體、宿主細胞或藥物。

54、本發(fā)明取得如下有益效果：1.高特異性：能夠區(qū)分her2肽與野生型肽，很好地實現(xiàn)特異性對腫瘤組織的殺傷，提高患者生存率和生活質(zhì)量。2.安全性提升：降低對正常組織的毒副作用；3.臨床應(yīng)用潛力大：可用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌等多種her2突變相關(guān)腫瘤。