本發明涉及生物，特別是涉及3’?utr元件、重組載體及其制備方法和應用。

背景技術：

1、大腦組織主要由執行信息處理功能的神經元和提供支持功能的神經膠質細胞構成。在諸如阿爾茨海默病、帕金森病、多發性硬化癥等神經系統退行性疾病中，病理核心常與神經元的進行性損傷和死亡密切相關。因此，通過基因遞送手段實現神經營養因子等治療性蛋白在神經元中的長期、穩定表達，成為一種極具前景的治療策略。在這一背景下，3’utr因其能夠直接調控mrna的穩定性、翻譯效率及最終的蛋白產量，并在神經元的發育、功能維持、可塑性及再生過程中扮演關鍵角色，其重要性日益凸顯。然而，現有的3’?utr未得到充分優化，基因表達的細胞特異性有待提高。

技術實現思路

1、基于此，本申請提供3’?utr元件、重組載體及其制備方法和應用。采用本申請的3’utr元件能夠實現外源基因在神經元宿主細胞中的特異性高效表達。

2、本申請第一方面提供一種3’?utr元件，所述3’?utr元件的核苷酸序列含有：從肌動蛋白家族1基因的終止密碼子開始至正義鏈的poly?a加尾信號位點之間的片段序列，所述poly?a加尾信號位點的核苷酸序列為：aataaa；及/或，所述片段序列的長度為719?bp，所述3’?utr元件的核苷酸序列如seq?id?no:?1所示。

3、本申請發明人選擇肌動蛋白γ1（actin?gamma?1,?actg1）基因，對mrna的3’?utr進行了深入分析與創新性設計，通過系統的篩選與功能驗證，成功獲得一種新型3’?utr元件（命名為actg1元件）。經試驗驗證，與目前在神經科學研究及基因治療領域中廣泛使用的牛生長激素poly?a信號（bghpa）相比，該actg1元件在應用于raav載體時，能夠在外源基因遞送至大腦后，在神經元中實現同等高效、持久且更具細胞類型特異性的表達。

4、本申請第二方面提供一種重組載體，所述重組載體攜帶有上述所述的3’?utr元件。

5、在一些實施例中，所述重組載體為包裝有所述3’?utr元件的重組腺相關病毒表達載體；

6、進一步地，所述重組載體還攜帶有熒光蛋白報告基因和pcalm1啟動子。

7、本申請第三方面提供上述重組載體的構建方法，包括如下步驟：

8、構建骨架載體，并將所述骨架載體線性化，所述骨架載體為腺相關病毒骨架載體，且含有熒光蛋白報告基因；

9、采用pcr擴增技術進行擴增，獲得所述3’?utr元件的基因片段；

10、將線性化的所述骨架載體與所述3’?utr元件的基因片段連接，得到所述重組載體。

11、在一些實施例中，所述采用pcr擴增技術進行擴增，獲得所述3’?utr元件的基因片段的步驟中，所用的擴增引物對含有與actg1模板互補的序列，且5’端包含與線性化的所述骨架載體兩端序列同源的臂區；

12、進一步地，所述擴增引物對的核苷酸序列為如seq?id?no:?2-?seq?id?no:3所示。

13、本申請第四方面提供一種重組病毒，所述重組病毒包裝有上述所述的重組載體。

14、在一些實施例中，所述重組病毒為重組腺相關病毒。

15、本申請第五方面提供上述重組病毒的構建方法，包括如下步驟：

16、將所述重組載體、包裝載體與輔助載體共轉染293t細胞，分離病毒，得到所述重組病毒。

17、本申請第六方面提供上述所述的3’?utr元件、或上述所述的重組載體、或上述所述的重組病毒在制備神經環路示蹤的相關試劑及/或藥物、及/或神經系統基因治療藥物中的應用。

18、本申請第七方面提供一種神經系統治療藥物，包括：上述所述的重組病毒。

19、在一些實施例中，還包括第二病毒，所述第二病毒包含來源于rtn1基因的3’?utr元件；其中，所述重組病毒與所述第二病毒的病毒基因組滴度比例為（1：10）至（10：1）。

1.?一種3’?utr元件，其特征在于，所述3’?utr元件的核苷酸序列含有：從肌動蛋白家族1基因的終止密碼子開始至正義鏈的poly?a加尾信號位點之間的片段序列，所述poly?a加尾信號位點的核苷酸序列為：aataaa；及/或，所述片段序列的長度為719?bp，所述3’?utr元件的核苷酸序列如seq?id?no:?1所示。

2.?一種重組載體，其特征在于，所述重組載體攜帶有權利要求1所述的3’?utr元件。

3.?根據權利要求2所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為包裝有所述3’?utr元件的重組腺相關病毒表達載體；所述重組載體還攜帶有熒光蛋白報告基因和pcalm1啟動子。

4.權利要求2-3任一項重組載體的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

5.?根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述采用pcr擴增技術進行擴增，獲得所述3’?utr元件的基因片段的步驟中，所用的擴增引物對含有與actg1模板互補的序列，且5’端包含與線性化的所述骨架載體兩端序列同源的臂區；所述擴增引物對的核苷酸序列如seq?id?no:?2-?seq?id?no:?3所示。

6.一種重組病毒，其特征在于，所述重組病毒包裝有權利要求2-3任一項所述的重組載體。

7.根據權利要求6所述的重組病毒，其特征在于，所述重組病毒為重組腺相關病毒。

8.權利要求6-7任一項所述的重組病毒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

9.?權利要求1所述的3’?utr元件、或權利要求2-3任一項所述的重組載體、或權利要求6-7任一項所述的重組病毒在制備神經環路示蹤的相關試劑及/或藥物、及/或神經系統基因治療藥物中的應用。

10.一種神經系統治療藥物，其特征在于，包括：權利要求6-7任一項所述的重組病毒。

11.?根據權利要求10所述的神經系統治療藥物，其特征在于，還包括第二病毒，所述第二病毒包含來源于rtn1基因的3’?utr元件；其中，所述重組病毒與所述第二病毒的病毒基因組滴度比例為（1：10）至（10：1）。