本發(fā)明屬于免疫學(xué)，尤其涉及一種抗sars-cov和sars-cov-2的全人源單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、冠狀病毒是一類具有囊膜的單股正鏈rna病毒，其在系統(tǒng)分類上屬套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬。其中，β屬冠狀病毒包括多種可感染人類并引起嚴(yán)重呼吸道疾病的病原體，如嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（sars-cov）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（mers-cov）以及新型冠狀病毒（sars-cov-2）。sars-cov-2與sars-cov在序列結(jié)構(gòu)上具有高度同源性，兩者均利用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ace2）作為感染細(xì)胞的功能受體。病毒入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵在于其表面的刺突蛋白（s蛋白）與人體細(xì)胞表面的ace2受體結(jié)合，其中受體結(jié)合域（rbd）是中和抗體識(shí)別的重要靶點(diǎn)。研究表明，針對(duì)s蛋白rbd的中和抗體能夠阻斷病毒與受體的結(jié)合，從而有效抑制病毒侵染細(xì)胞。
2、全人源抗體因其低免疫原性和高安全性而成為治療性抗體藥物研發(fā)的重要趨勢(shì)。當(dāng)前，中和單抗可以通過雜交瘤技術(shù)、人源化轉(zhuǎn)基因小鼠、噬菌體文庫篩選及單細(xì)胞pcr技術(shù)等進(jìn)行制備。單細(xì)胞pcr技術(shù)的原理是病毒感染恢復(fù)者或疫苗接種者體內(nèi)存在對(duì)抗病毒的保護(hù)性單克隆抗體，編碼抗體的基因位于人體外周血單個(gè)淋巴細(xì)胞內(nèi)，通過流式細(xì)胞儀分選和單細(xì)胞pcr技術(shù)可以擴(kuò)增獲得此基因，隨后通過基因工程手段，實(shí)現(xiàn)體外規(guī)模化制備候選抗體分子，具有全人源、天然穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于中和抗體研發(fā)。
3、由于sars-cov與sars-cov-2的相似性，且后者病毒變異帶來的免疫逃逸問題日益顯著。sars-cov-2作為rna病毒，在復(fù)制過程中容易發(fā)生突變，導(dǎo)致其抗原性發(fā)生變化，使得一些早期研發(fā)的單克隆抗體藥物失效或中和能力大幅降低。為了解決這一問題，研究廣譜交叉中和抗體成為重要方向。例如，cr3022是一種sars-cov中和抗體，通過定向進(jìn)化技術(shù)使其對(duì)sars-cov-2?rbd的親和力提高了1000倍以上，并具有sars-cov-2中和作用。同樣，一些研究機(jī)構(gòu)也開發(fā)了雙特異性中和抗體，能夠同時(shí)識(shí)別sars-cov-2和sars-cov等不同冠狀病毒。
4、目前能夠同時(shí)有效中和sars-cov和sars-cov-2的全人源單克隆抗體仍然有限，且其分子機(jī)制和應(yīng)用潛力有待進(jìn)一步探索。因此，開發(fā)具有交叉中和活性的全人源單克隆抗體，對(duì)于應(yīng)對(duì)冠狀病毒變異和未來可能出現(xiàn)的新的冠狀病毒具有重要的科學(xué)價(jià)值和臨床應(yīng)用意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種抗sars-cov和sars-cov-2的全人源單克隆交叉中和抗體及其應(yīng)用；所述單克隆抗體具有成為抗冠狀病毒廣譜藥物的潛力，能夠用于冠狀病毒預(yù)防和治療。
2、本發(fā)明提供了一種抗sars-cov和sars-cov-2的單克隆抗體sars2-1，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:1所示；所述單克隆抗體sars2-1的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:2所示。
3、優(yōu)選的，所述單克隆抗體sars2-1的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:3所示；所述單克隆抗體sars2-1的輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:4所示。
4、本發(fā)明提供了編碼所述的單克隆抗體sars2-1的核酸序列，包括如seq?id?no:5所示的編碼重鏈可變區(qū)的核酸序列、如seq?id?no:6所示的編碼輕鏈可變區(qū)的核酸序列、如seq?id?no:7所示的編碼重鏈恒定區(qū)的核酸序列和如seq?id?no:8所示的編碼輕鏈恒定區(qū)的核酸序列。
5、本發(fā)明提供了表達(dá)所述的單克隆抗體sars2-1的重組載體，包括初始載體、編碼單克隆抗體sars2-1重鏈可變區(qū)的核酸序列和編碼單克隆抗體sars2-1輕鏈可變區(qū)的核酸序列。
6、優(yōu)選的，所述初始載體為包含編碼單克隆抗體sars2-1的輕鏈恒定區(qū)的核酸序列和編碼單克隆抗體sars2-1的重鏈恒定區(qū)的核酸序列的真核表達(dá)載體。
7、本發(fā)明提供了一種表達(dá)所述的單克隆抗體sars2-1的重組細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)入所述的重組載體獲得所述重組細(xì)胞；所述宿主細(xì)胞為expi?293f細(xì)胞或者cho-s細(xì)胞。
8、本發(fā)明提供了所述的單克隆抗體sars2-1、所述的核酸序列、所述的重組載體、所述的重組細(xì)胞在制備預(yù)防和/或治療冠狀病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
9、本發(fā)明提供了所述的單克隆抗體sars2-1、所述的核酸序列、所述的重組載體、所述的重組細(xì)胞在制備檢測(cè)冠狀病毒感染的試劑中的應(yīng)用。
10、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明提供的抗sars-cov和sars-cov-2的全人源單克隆交叉中和抗體sars2-1，所述抗體具有獨(dú)特的cdr分區(qū)，可同時(shí)識(shí)別上述兩種病毒s蛋白，并對(duì)上述兩種病毒的假病毒具有交叉中和活性。所述單克隆抗體sars2-1與新冠變異株ba.1、xbb.1.16、jn.1和sars-cov抗原蛋白的結(jié)合ec50值分別為15.85?ng/ml、8.736?ng/ml、9.804?ng/ml和11.68?ng/ml。在假病毒中和實(shí)驗(yàn)中，所述抗體對(duì)新冠假病毒野生型、jn.1和假病毒sars-cov的ic50值是8.305?μg/ml、1.720?μg/ml和0.6233?μg/ml。所述抗體可以有效中和假病毒sars-cov-2和假病毒sars-cov。
11、本發(fā)明提供的單克隆抗體sars2-1具有高表達(dá)、全人源、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)于應(yīng)對(duì)目前及將來可能出現(xiàn)的冠狀病毒導(dǎo)致的爆發(fā)流行具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
1.一種抗sars-cov和sars-cov-2的單克隆抗體sars2-1，其特征在于，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:1所示；所述單克隆抗體sars2-1的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體sars2-1，其特征在于，所述單克隆抗體sars2-1的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:3所示；所述單克隆抗體sars2-1的輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:4所示。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體sars2-1的核酸序列，其特征在于，包括如seqid?no:5所示的編碼重鏈可變區(qū)的核酸序列、如seq?id?no:6所示的編碼輕鏈可變區(qū)的核酸序列、如seq?id?no:7所示的編碼重鏈恒定區(qū)的核酸序列和如seq?id?no:8所示的編碼輕鏈恒定區(qū)的核酸序列。
4.表達(dá)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體sars2-1的重組載體，其特征在于，包括初始載體、編碼單克隆抗體sars2-1重鏈可變區(qū)的核酸序列和編碼單克隆抗體sars2-1輕鏈可變區(qū)的核酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述初始載體為包含編碼單克隆抗體sars2-1的輕鏈恒定區(qū)的核酸序列和重鏈恒定區(qū)的核酸序列的真核表達(dá)載體。
6.一種表達(dá)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體sars2-1的重組細(xì)胞，其特征在于，在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)入權(quán)利要求4或5所述的重組載體獲得所述重組細(xì)胞；所述宿主細(xì)胞為expi?293f細(xì)胞或者cho-s細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體sars2-1、權(quán)利要求3所述的核酸序列、權(quán)利要求4或5所述的重組載體、權(quán)利要求6所述的重組細(xì)胞在制備預(yù)防和/或治療冠狀病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體sars2-1、權(quán)利要求3所述的核酸序列、權(quán)利要求4或5所述的重組載體、權(quán)利要求6所述的重組細(xì)胞在制備檢測(cè)冠狀病毒感染的試劑中的應(yīng)用。