本發明涉及試劑盒制備，具體涉及一種低背景值的試劑盒的制備方法。

背景技術：

1、酶促化學發光免疫分析(chemiluminescence?enzyme?immunoassay，cleia)是利用標記酶的催化作用，使發光劑(底物)發光，這一類需酶催化后發光的發光劑稱為酶促反應發光劑或酶促發光底物。酶促反應的發光底物是指經酶的降解作用而發出光的一類發光底物，目前化學發光酶免疫技術中常用的酶有辣根過氧化物酶(hrp)和堿性磷酸酶(ap)。利用酶如堿性磷酸酶(ap)來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應的抗原(抗體)發生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復合物，經洗滌后，加入底物(發光劑)，ap酶催化和分解底物發光，由光量子閱讀系統接收，光電倍增管將光信號轉變為電信號并加以放大，再把它們傳送至計算機數據處理系統，計算出測定物的濃度。

2、化學發光試劑往往由兩個關鍵部分組成，分別是抗體—磁珠的固相試劑和抗體—酶的標記試劑。在免疫反應實驗中，往往會受到異嗜性抗體、類風濕因子等內源性物質的干擾，這類情況可以通過稀釋或添加合適的阻斷劑等方法來排除干擾。但是對于試劑本身，如磁珠的異常聚集，一些游離的未標記上抗原或抗體的發光物質的存在，都會導致試劑的背景值過高，進而影響到臨床低濃度標本測值的準確性。

3、專利cn112362864b公布了一種降低免疫診斷試劑背景發光值的處理劑的制備方法，將其用于化學發光儀器的清洗液或是作為試劑中的一個組分，應用于實驗反應體系中，可將免疫診斷試劑的背景發光值有效的降低，但處理劑的組分復雜，可能會對免疫反應實驗中的其他組分帶來影響。專利cn110702907a公布了一種降低發光底物自身本底的酶促化學發光免疫檢測方法，應用于所用的標記酶是hrp的化學發光方法，但該方法不適用以堿性磷酸酶為標記的化學發光法。

技術實現思路

1、針對現有技術酶促化學發光免疫分析中存在的磁珠的異常聚集，一些游離的未標記上抗原或抗體的發光物質的存在，導致試劑的背景值過高，進而影響到臨床低濃度標本測值的準確性的問題，本發明提供一種低背景值的試劑盒的制備方法，可以有效解決免疫診斷試劑中背景發光值過高的問題，大大地提高產品的靈敏度和產品質量，能滿足臨床要求，以減少誤診現象的發生。

2、為了解決上述技術問題，本發明提供如下技術方案：

3、一種低背景值的試劑盒的制備方法，包括抗體包被的磁微粒和標記了堿性磷酸酶的抗體的制備；

4、所述標記了堿性磷酸酶的抗體的制備方法包括以下步驟：

5、（1）堿性磷酸酶的活化：將n-琥珀酰亞胺基-s-乙酰硫基乙酸酯加入含堿性磷酸酶的緩沖液中進行交聯反應，反應完成后經淬滅、透析、活化和再次透析后獲得活化的堿性磷酸酶；

6、（2）抗體的活化：對抗體進行巰基封閉的預處理，將磺基琥珀酰亞胺-4-( n-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸鹽與預處理后的抗體進行交聯反應，反應完成后經淬滅、透析獲得活化的抗體；

7、（3）活化后的堿性磷酸酶與活化后的抗體的偶聯：將上述步驟（1）獲得的活化的堿性磷酸酶與步驟（2）獲得的活化的抗體混合后孵育反應，反應完成后，經封閉、透析后獲得標記了堿性磷酸酶的抗體。

8、進一步地，步驟（1）中含堿性磷酸酶的緩沖液為非胺緩沖液，所述非胺緩沖液為ph7.2~8.0的pbs或hepes緩沖液；n-琥珀酰亞胺基-s-乙酰硫基乙酸酯與含堿性磷酸酶的緩沖液中的交聯反應條件為：室溫反應0.5~3h或者2~8℃反應12~18h，n-琥珀酰亞胺基-s-乙酰硫基乙酸酯與堿性磷酸酶的摩爾比為10~100:1。

9、進一步地，步驟（1）和步驟（2）中淬滅條件為：向交聯反應后的反應液中加入10%（v/v，體積比）的ph為7.2、濃度為1m的甘氨酸緩沖液，室溫反應0.5~2h。

10、進一步地，步驟（2）中抗體進行巰基封閉的預處理的方法為：將質量濃度為0.1~1%的1m的巰基封閉劑加入到含抗體的ph7.2~8.0、0.01~0.1m的非胺緩沖液中，室溫反應0.5~1h；

11、所述巰基封閉劑為氯乙酰氨。

12、進一步地，步驟（2）中磺基琥珀酰亞胺-4-(n-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸鹽與預處理后的抗體的交聯反應條件為：室溫反應0.5~3h或者2~8℃反應12~18h，磺基琥珀酰亞胺-4-(n-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸鹽與抗體的摩爾比為10~100:1。

13、進一步地，步驟（3）中孵育反應條件為：室溫反應2~4h或者2~8℃反應18~24h。其中堿性磷酸酶與抗體的摩爾比為1:1~3，優選比例為1:1。

14、進一步地，抗體包被的磁微粒的制備方法包括以下步驟：

15、（a）磁微粒的活化；

16、（b）抗體-磁微粒的偶聯；

17、（c）封閉、洗滌。

18、進一步地，抗體-磁微粒的偶聯方法為：抗體用100mm?mes緩沖液稀釋，并將活化后的羧基磁微粒緩慢加至上述稀釋好的抗體中，渦旋混勻，室溫孵育3h；抗體：磁微粒質量比為1:20~1:200，優選為1:100。

19、進一步地，封閉、洗滌的方法為：

20、將偶聯的抗體-磁微粒，用磁板吸附后棄上清，然后加入ph7.5的第一封閉液，封閉液含有0.02-0.1m?tris、150mm?nacl、0.05%?tween20、0.05%疊氮鈉、0.02~0.1m氨基酸，室溫封閉30min；

21、取上述封閉磁珠，再次用磁板吸附，棄上清，然后加入ph7.5的第二封閉液，封閉液含有0.02-0.1m?tris、150mm?nacl、0.05%?tween20、0.05%疊氮鈉、1~5%蛋白封閉劑，室溫封閉2~4小時；

22、取上述封閉磁珠，磁板吸附，棄上清，用ph7.4的tbst緩沖液洗滌3次，每次洗滌完后用磁板吸附，棄上清，tbst緩沖液含有0.1m?tris、150mm?nacl，0.05%?tween20；

23、用緩沖液保存偶聯的抗體-磁微粒，即制備得到抗體包被的磁微粒。

24、根據上述方法制備得到的低背景值的試劑盒。

25、本發明具有如下所述的有益效果:

26、1、本發明提供的一種低背景值的試劑盒的制備方法，抗體酶標技術使用了先進的異雙官能團交聯法，相比以往的戊二醛法、高碘酸鈉法，交聯效率提升明顯，添加巰基封閉劑，減少檢測過程中會出現的非特異性反應，以及在活化抗體前，封閉抗體上游離的巰基，避免活化后的抗體自連，提高交聯效率，相比現有的偶聯工藝，背景值更低。

27、2、本發明提供的一種低背景值的試劑盒的制備方法，活化完酶或抗體后，加入淬滅劑，淬滅掉多余的交聯劑，防止殘余的交聯劑與無關蛋白反應。

28、3、本發明提供的一種低背景值的試劑盒的制備方法，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽作為活化劑，使sulfo-nhs與羧基偶聯，形成比o-酰基異脲中間體穩定許多的nhs酯，使用的非胺緩沖液，不參與和干擾生物化學反應，能夠更好的使得活化后的羧基磁珠與抗體偶聯。