本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體為免疫細(xì)胞和中醫(yī)組方在癌癥治療藥物制備中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、自然殺傷（nk）細(xì)胞是具有強(qiáng)大細(xì)胞毒性活性的先天性淋巴細(xì)胞，它作為潛在的抗癌療法引起關(guān)注，但nk細(xì)胞輸注在實(shí)體瘤患者中的治療效果卻有限。治療過程受到幾種因素的阻礙，例如腫瘤浸潤不充分和在腫瘤微環(huán)境（tme）中的持續(xù)/激活。tme的一些代謝特征，包括缺氧以及腺苷、活性氧和前列腺素水平的升高，對nk細(xì)胞的活性都有負(fù)面影響。此外，癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞、腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞、骨髓源性抑制細(xì)胞和調(diào)節(jié)性t細(xì)胞積極抑制nk細(xì)胞依賴的抗癌免疫。

2、一些環(huán)境因素會阻止過繼性轉(zhuǎn)移的nk細(xì)胞聚集到實(shí)體瘤的tme中，限制它們在其中的持續(xù)存在和/或抑制它們的細(xì)胞毒性，影響nk細(xì)胞活性的環(huán)境因素主要包括受損的nk細(xì)胞販運(yùn)、缺氧、ros、pge2、腺苷。

3、多種因素調(diào)控nk細(xì)胞販運(yùn)，包括整合素、選擇素和趨化因子受體。在實(shí)體瘤中，nk細(xì)胞會招募cxcr3。ifn或ifng通路刺激cxcr3的配體cxcl9，cxcl10和cxcl11分泌，被證實(shí)在多種腫瘤環(huán)境中和nk細(xì)胞浸潤有關(guān)。因此，旨在提高nk細(xì)胞的cxcr3表達(dá)和/或在tme中分泌cxcr3配體的策略可能會導(dǎo)致nk細(xì)胞被招募到實(shí)體瘤的腫瘤微環(huán)境中。其他趨化因子受體包括cxcr4,ccr7,cx3cr1都被證實(shí)可以將nk細(xì)胞招募到實(shí)體瘤微環(huán)境中。

4、因?yàn)檠苋毕莺途植啃柩趿康脑黾樱瑢?shí)體瘤的腫瘤微環(huán)境常處于缺氧狀態(tài)。這種環(huán)境會抑制erk信號，減少stat3的目標(biāo)基因，促進(jìn)多種損傷nk細(xì)胞功能的表面受體。這對nk細(xì)胞造成了多種不利影響：（1）抑制erk信號，減少stat3表達(dá)的目標(biāo)基因；（2）促進(jìn)多種損傷nk細(xì)胞功能的表面受體；（3）引起nk細(xì)胞線粒體破碎；（4）通過多種免疫抑制細(xì)胞干擾nk細(xì)胞功能。逆轉(zhuǎn)缺氧是恢復(fù)實(shí)體瘤tme中nk細(xì)胞功能的一個潛在策略。另一種方法是使nk細(xì)胞對低氧水平的耐受性更強(qiáng)。

5、ros在實(shí)體瘤微環(huán)境中富集，可以通過多個包括免疫逃逸在內(nèi)的機(jī)制促進(jìn)疾病發(fā)展。事實(shí)上，nk細(xì)胞對ros的基因毒性和細(xì)胞毒性作用特別敏感。除了在高ros水平下產(chǎn)生的細(xì)胞毒性機(jī)制，ros引起的損害nk細(xì)胞抗癌活性的機(jī)制之一與nk細(xì)胞膜性質(zhì)變化有關(guān)。具體表現(xiàn)為ros促進(jìn)nk細(xì)胞表面陰離子點(diǎn)惡化的積累，限制了它們與目標(biāo)腫瘤細(xì)胞的粘附。除了清除ros和抑制ros產(chǎn)生系統(tǒng)之外，提高nk細(xì)胞對ros的耐受性也是一種抗癌的潛在方法。作為強(qiáng)效nk細(xì)胞激活劑的il15，可以通過mtor依賴性機(jī)制上調(diào)nk細(xì)胞中的硫氧還蛋白（txn），增加細(xì)胞表面還原性硫醇的可用性，最終在環(huán)境氧化壓力下仍能保持細(xì)胞毒性功能。

6、各種腫瘤的出現(xiàn)和發(fā)展都是在慢性、惰性炎癥反應(yīng)的背景下進(jìn)行的，這些炎癥反應(yīng)最終促進(jìn)了免疫逃避，這就是通常所說的腫瘤促進(jìn)性炎癥（tpi）。ptger4（ep4）激動劑已被證明能有效地抑制小鼠nk細(xì)胞產(chǎn)生ifng和對血清趨化因子的趨化反應(yīng)。在臨床前模型中，ep4的藥理抑制可以保護(hù)nk細(xì)胞免受pge2的免疫抑制作用，從而保留效應(yīng)功能和抗轉(zhuǎn)移活性。

7、腺苷是atp降解的最終產(chǎn)品，因?yàn)槟[瘤微環(huán)境導(dǎo)致免疫細(xì)胞壓力和死亡，大量atp釋放積累在細(xì)胞外環(huán)境中。腺苷結(jié)合免疫細(xì)胞上的腺苷a2a受體（adora2a）或者腺苷a2b受體（adora2b），調(diào)控免疫抑制反應(yīng)。這個過程已被證實(shí)可以抑制nk細(xì)胞參與的細(xì)胞因子釋放。中斷a2ar和/或a2br激活的藥理和遺傳策略已被證明可以在各種實(shí)驗(yàn)環(huán)境中防止腺苷引起的nk細(xì)胞功能障礙。

8、此外，一些tme的免疫和基質(zhì)區(qū)間也會抑制nk細(xì)胞的效應(yīng)功能。因此，靶向包括treg，tams，mdscs和cafs在內(nèi)的細(xì)胞群是一種賦予腫瘤浸潤性nk細(xì)胞效應(yīng)功能的潛在方式。影響nk細(xì)胞最佳細(xì)胞活性的免疫和基質(zhì)障礙主要包括treg、tam、mdscs、cafs。

9、腫瘤浸潤的treg細(xì)胞通過直接的、依賴接觸的途徑以及直接和間接的體液機(jī)制介導(dǎo)強(qiáng)大的免疫抑制作用。人類和小鼠的nk細(xì)胞對treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制高度敏感，通常導(dǎo)致nk細(xì)胞激活受體的表達(dá)減少，共同抑制受體的上調(diào)。tams是腫瘤微環(huán)境中非常具有可塑性，可以適應(yīng)一系列的表型和功能特征，如促炎癥狀態(tài)（m1樣tams）或抗炎癥狀態(tài)（m2樣tams）。從小鼠乳腺癌中分離出來的m2樣tams已被證明能有效地抑制nk細(xì)胞的細(xì)胞毒性。mdscs可以被分為cd11b+cd14+cd33+hla-drlow/neg單核細(xì)胞（m）-mdscs或cd11b+cd15+hla-drlowcd66b+粒細(xì)胞（g）-或多形核（pmn）-mdscs。在小鼠癌癥模型中，cd11b+gr1+mdscs出現(xiàn)頻率與nk細(xì)胞受體表達(dá)量、ifng和prf1的量成反比。腫瘤被高度可塑和功能異質(zhì)性的cafs種群浸潤，它可以直接抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞，通過產(chǎn)生大量tgfb1或者下調(diào)pvr細(xì)胞（nk細(xì)胞受體之一）粘附性，抑制nk細(xì)胞功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：如何改善nk細(xì)胞在腫瘤的過繼細(xì)胞免疫療法中的活性。

2、為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、免疫細(xì)胞和中醫(yī)組方在癌癥治療藥物制備中的應(yīng)用，所述免疫細(xì)胞為nk細(xì)胞；所述中醫(yī)組方包括以下重量份的成分：絞股藍(lán)12~16份，白花蛇舌草8~10份，防風(fēng)8~10份，羌活6~8份，楮實(shí)子6~8份，地骨皮5~7份，補(bǔ)骨脂2~3份，白蔻1~2份，雞骨草1~2份，麥冬0.5~1份，熟地黃0.5~1份，白芷0.5~1份，菟絲子0.2~0.5份，卷柏0.2~0.5份；所述中醫(yī)組方的給藥方法為口服；所述免疫細(xì)胞的給藥方法為靜脈回輸；所述免疫細(xì)胞的靜脈回輸單次劑量為0.5~0.7×109個；從執(zhí)行首次所述靜脈回輸前3d開始，至完成末次所述靜脈回輸后40d為止，在此期間內(nèi)口服所述中醫(yī)組方，口服的日劑量為10~15g。

4、作為優(yōu)選，在該應(yīng)用中，將所述中醫(yī)組方制成中藥提取物，再進(jìn)行給藥；所述中藥提取物是由以下方法制備的：將配方量的絞股藍(lán)、白花蛇舌草、防風(fēng)、羌活、楮實(shí)子、地骨皮、補(bǔ)骨脂在球磨機(jī)中粉碎，過200~220目篩得到第一粉末，將第一粉末與乙醇水溶液混合，超聲處理后，進(jìn)行回流提取，過濾，合并濾液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到第一組分；將配方量的白蔻、雞骨草、麥冬、熟地黃、白芷、菟絲子、卷柏在球磨機(jī)中粉碎，過150~180目篩得到第二粉末，將第二粉末在水中浸泡，然后進(jìn)行回流提取，過濾，合并濾液，離心，所得上清液減壓濃縮，冷凍干燥，得到第二組分；將所述第一組分與所述第二組分混合，得到所述中藥提取物。

5、作為優(yōu)選，第一粉末和乙醇水溶液的質(zhì)量體積比為1:6~1:15?g:ml，乙醇水溶液的體積濃度為65~75％。

6、作為優(yōu)選，所述超聲處理的時(shí)長為80~100min，超聲換能器的功率為300~400w，超聲震蕩頻率為28~35khz。

7、作為優(yōu)選，所述回流提取的次數(shù)為2~3次，每次持續(xù)1~2h。

8、作為優(yōu)選，第二粉末和水的質(zhì)量體積比為1:10~1:16?g:ml，浸泡的時(shí)長為4～5h，浸泡水溫為50~60℃。

9、作為優(yōu)選，所述減壓濃縮的溫度為60~65℃；所述冷凍干燥的溫度為-45~-50℃，壓強(qiáng)為120~150pa。

10、作為優(yōu)選，所述中醫(yī)組方由以下重量份的成分組成：絞股藍(lán)14份，白花蛇舌草9份，防風(fēng)9份，羌活7份，楮實(shí)子7份，地骨皮6份，補(bǔ)骨脂2.5份，白蔻1.5份，雞骨草1.5份，麥冬0.8份，熟地黃0.7份，白芷0.8份，菟絲子0.3份，卷柏0.4份。

11、作為優(yōu)選，所述nk細(xì)胞是由以下方法制備的：準(zhǔn)備100ml外周血或臍帶血樣本，使用ficoll分離液從血液樣本中提取pbmc；利用nk細(xì)胞分選試劑盒，通過磁珠陰選技術(shù)從pbmc中分離出流式細(xì)胞術(shù)檢測純度≥95％的cd3-cd56+nk細(xì)胞；將分離得到的cd3-cd56+nk細(xì)胞接種于nk細(xì)胞培養(yǎng)基中，進(jìn)行體外培養(yǎng)20d；所述nk細(xì)胞培養(yǎng)基是含有50~150μg/ml發(fā)菜多糖、1500u/ml?il-6的dmem/f12或imdm。

12、作為優(yōu)選，所述癌癥為結(jié)腸癌、肺癌、胃癌或肝癌。

13、本發(fā)明提供了免疫細(xì)胞和中醫(yī)組方在癌癥治療藥物制備中的應(yīng)用。該技術(shù)方案通過靜脈回輸nk細(xì)胞實(shí)現(xiàn)對實(shí)體腫瘤的免疫治療，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了具有增效作用的中醫(yī)組方。具體來看，本發(fā)明以0.5~0.7×109個的單次劑量注射nk細(xì)胞，從執(zhí)行首次注射前3d開始，至完成末次注射后40d為止，在此期間內(nèi)口服含有絞股藍(lán)、白花蛇舌草、防風(fēng)、羌活、楮實(shí)子、地骨皮、補(bǔ)骨脂、白蔻、雞骨草、麥冬、熟地黃、白芷、菟絲子、卷柏等成分的中醫(yī)組方，可顯著增進(jìn)實(shí)體腫瘤和腫瘤細(xì)胞的抑制效果，并提升巨噬細(xì)胞的免疫功能。而且，本發(fā)明對實(shí)驗(yàn)動物主要臟器無明顯的毒副作用，顯示出良好的生物相容性和安全性。