本發明屬于生物，更具體地，涉及opa1富集外泌體在制備改善線粒體功能障礙的藥物中的應用。

背景技術：

1、機體在進行氧化代謝時，線粒體中的etc容易因電子大量漏出使氧分子還原形成活性氧（reactive?oxygen?species，ros），過多ros導致mtdna突變，引起線粒體功能障礙，影響線粒體穩態，引發各種疾病。

2、外泌體（exosomes）是由細胞分泌的含有核酸、蛋白和脂質的微小囊泡，外泌體具有高效靶向性與穿透生物屏障能力、低免疫原性與高生物相容性、多功能載荷與聯合治療潛力、能減少副作用與增強穩定性、天然來源與規模化潛力，因此可用作藥物遞送載體，用于治療多種疾病。

3、opa1（optic?atrophy?1）是一種線粒體內膜融合蛋白，參與調節線粒體的融合過程。研究表明，opa1在調節線粒體的融合與分裂過程中起著關鍵作用，這對于維持線粒體的生物能量產生和細胞的代謝穩態至關重要。線粒體的形態變化直接影響其功能，opa1的缺失會導致線粒體的碎片化，從而影響細胞的能量代謝和生存能力。opa1能夠減輕細胞的氧化應激損傷，改善線粒體功能障礙相關疾病，然而opa1蛋白本身不存在外泌體中，限制了其以外泌體的形式用于線粒體功能障礙的治療。

技術實現思路

1、本發明的目的在于克服現有技術中存在的上述缺陷和不足，提供opa1富集外泌體在制備改善線粒體功能障礙的藥物中的應用。

2、本發明的第二個目的在于提供opa1富集外泌體在制備治療由線粒體功能障礙導致的相關疾病的藥物中的應用。

3、本發明的上述目的是通過以下技術方案給予實現的：

4、本發明首先制備了opa1富集外泌體（opa1-exo），是先將多肽p13與opa1形成融合蛋白opa1-p13，再構建表達該融合蛋白opa1-p13的重組質粒并轉染細胞培養，提取外泌體，即得到opa1富集外泌體opa1-exo；即將多肽p13的編碼序列與opa1蛋白編碼序列的3’端或5’相連獲得opa1-p13融合基因，再構建表達opa1-p13融合基因的重組質粒，然后將該重組質粒轉染至細胞進行共表達，提取外泌體即得opa1富集外泌體opa1-exo；所述多肽p13的氨基酸序列如seq?id?no.1～4任一所示。

5、多肽（peptide）是由氨基酸通過肽鍵連接形成的分子，能夠促進蛋白質之間的相互作用，從而形成穩定的三元復合物或增強已有的蛋白-蛋白相互作用。

6、cd9又稱四跨膜蛋白9，屬于四跨膜蛋白超家族，是一種重要的膜蛋白。cd9是外泌體的標志性蛋白之一，天然存在于外泌體膜上，常用于外泌體的檢測、分離和鑒定，尤其是在工程化外泌體靶向應用中具有重要意義。

7、本發明通過將噬菌體庫與cd9蛋白孵化培養篩選出靶向結合cd9的多肽p13，將其通過基因重組技術連接在opa1蛋白末端形成融合蛋白opa1-p13，以促進opa1與cd9結合，由于cd9是本身就存在于外泌體中的一種跨膜蛋白，通過多肽p13可以將opa1蛋白與cd9結合，從而可以幫助opa1蛋白實現從細胞核向外泌體的跨細胞器轉運，使其能夠富集在外泌體中。具體地，通過構建表達融合蛋白opa1-p13的重組質粒（即將多肽p13的編碼序列連接在opa1蛋白編碼序列的3’端或5’端，獲得opa1-p13融合基因，再構建表達opa1-p13融合基因的重組質粒），并轉染細胞培養；多肽p13可以鏈接opa1靶向外泌體中的cd9，促進opa1與cd9結合，得到opa1富集外泌體（opa1-exo）。在opa1蛋白、多肽p13氨基酸序列已知的情況下，本領域技術人員采用常規的技術手段即可獲得opa1蛋白、多肽p13的編碼基因序列，并根據宿主密碼子偏好性進行優化。

8、進一步地，還包括構建促囊泡分泌基因rab31的重組質粒，然后將上述表達opa1-p13融合基因的重組質粒與促外泌體分泌的rab31重組質粒這兩種重組質粒共轉染至細胞進行共表達，提取外泌體，即得opa1富集外泌體（opa1-rab31-exo）。rab31能進一步提高外泌體產量，進而提高外泌體中opa1蛋白的含量能提高外泌體產量，從而提高每毫升外泌體中opa1蛋白量。rab31蛋白是一種小gtp酶，屬于ras癌基因家族（rab亞家族），在細胞內膜運輸和信號調控中發揮關鍵作用。作為rab家族成員，rab31通過gtp結合態激活，招募下游效應蛋白，調控囊泡形成、運輸及與靶膜的融合。它對高爾基體和反式高爾基網絡（tgn）的功能完整性至關重要。在rab31蛋白氨基酸序列已知的情況下，本領域技術人員采用常規的技術手段即可獲得rab31蛋白的編碼基因序列，并根據宿主密碼子偏好性進行優化。

9、本發明將該opa1富集外泌體opa1-exo作用于h2o2誘導的氧化損傷的293t細胞模型，檢測細胞線粒體的抗氧化活性指標，結果顯示opa1富集外泌體opa1-exo對線粒體功能障礙具有明顯的改善作用，表明opa1蛋白成功通過外泌體表達的形式在線粒體功能障礙治療中發揮作用。

10、具體地，本發明將所述opa1富集外泌體opa1-exo加入到h2o2誘導的氧化損傷的293t細胞模型，評估其對細胞抗氧化應激的影響，測定細胞內抗氧化酶sod1、sod2、cat和gsh-px活性，ros含量和atp含量等指標，結果顯示，opa1-exo通過激活抗氧化酶降低293t細胞中的ros水平，通過促進氧化磷酸化途徑提高線體中atp含量，并改善線粒體網絡結構，恢復線粒體功能。表明opa1-exo在改善線粒體功能障礙，或治療線粒體功能障礙導致的相關疾病中具有應用價值。

11、因此，本發明首先提供上述opa1富集外泌體opa1-exo在制備改善線粒體功能障礙的藥物中的應用。

12、本發明還提供所述opa1富集外泌體opa1-exo在制備治療由線粒體功能障礙導致的相關疾病的藥物中的應用。

13、優選地，本發明還提供上述opa1富集外泌體opa1-rab31-exo在制備改善線粒體功能障礙的藥物或在制備治療由線粒體功能障礙導致的相關疾病的藥物中的應用。由于rab31能進一步提高外泌體中opa1蛋白量，因此opa1-rab31-exo相較于opa1-exo，可進一步提升對線粒體功能障礙的治療效果。

14、進一步地，所述線粒體功能障礙為由氧化損傷導致的線粒體功能障礙。

15、進一步地，所述藥物通過上調受試者體內抗氧化酶的表達來清除ros，促進受試者體內氧化磷酸化途徑提高atp含量，改善受試者線粒體網絡結構和恢復線粒體功能從而實現改善線粒體功能障礙。

16、進一步地，所述受試者選自哺乳動物。

17、進一步地，其中所述哺乳動物選自鼠、貓、狗、豬、牛、馬、羊、猴和人等。

18、進一步地，所述藥物還包括其他藥學上可接受的輔料。

19、進一步地，所述多肽p13的編碼序列與opa1蛋白編碼序列之間通過flag標簽連接，即多肽p13通過flag標簽連接opa1蛋白。

20、進一步地，所述多肽p13的編碼序列與opa1蛋白編碼序列的3’端相連接，即多肽p13連接于opa1蛋白的c端。本發明構建pcdna3.1-opa1-p13-c和pcdna3.1-opa1-p13-n重組質粒，將所述多肽p13通過基因重組技術連接于opa1蛋白的c端或n端，形成opa1-多肽p13融合蛋白表達系統，轉染細胞（工程基因細胞）后，成功構建得到了opa1富集外泌體。通過對n+和c+組opa1在轉染細胞（工程基因細胞）內、外泌體（工程外泌體）內、靶細胞（目標細胞）含量分析，在靶細胞中可見c+組存在更多opa1與線粒體的共定位，表明c端連接多肽p13可更有效促進靶細胞中opa1向線粒體轉運。

21、進一步地，所述多肽p13的氨基酸序列如seq?id?no.1所示：gkycmatccsmma。本發明通過12肽的噬菌體肽庫篩選出了4個多肽序列，能夠與cd9重組蛋白產生親和作用，經過噬菌體elisa檢測，序列為gkycmatccsmma的多肽具有更強的結合力。

22、進一步地，所述重組質粒的模板質粒為pcdna3.1，即構建pcdna3.1-?opa1-p13和pcdna3.1-rab31重組質粒。

23、進一步地，所述細胞為293t細胞。

24、進一步地，所述外泌體的提取方式為超速離心法。

25、與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

26、本發明提供了opa1富集外泌體在制備改善線粒體功能障礙的藥物中的應用。本發明通過將噬菌體庫與cd9重組蛋白孵化培養篩選出靶向多肽p13，將多肽p13與opa1蛋白形成融合蛋白opa1-p13，再構建表達該融合蛋白opa1-p13的重組質粒轉染細胞培養，多肽p13可以鏈接opa1靶向外泌體中的cd9，促進opa1與cd9結合，可以幫助opa1蛋白實現從細胞內向外泌體的跨細胞轉運、富集，提取外泌體即得到opa1富集外泌體opa1-exo。將opa1-exo用于線粒體功能障礙治療，結果顯示opa1-exo可激活抗氧化酶降低細胞中的ros水平，促進氧化磷酸化途徑提高線粒體atp含量，可以明顯改善線粒體網絡，使線粒體功能障礙得到恢復，從而顯示出明顯的線粒體功能修復潛力。本發明成功實現了將opa1蛋白通過外泌體的形式用于線粒體功能障礙的治療。