本申請屬于生物檢測，尤其涉及一種非診斷目的的供者特異性抗體的檢測方法。
背景技術(shù)：
1、移植物受者產(chǎn)生的針對供者移植物抗原的同種異體抗體則被定義為供者特異性抗體dsa。根據(jù)抗原載體不同，dsa的檢測方法包含細(xì)胞學(xué)和純化抗原法。
2、目前常規(guī)檢測dsa的方法為純化抗原法，雖然其操作簡單，但是由于技術(shù)限制存在著不可避免的假陰性和假陽性風(fēng)險。純化抗原法表面包被的微球種類非常有限，每一個經(jīng)典hla基因的人群覆蓋度只有約85%-90%，其次還會漏檢非hla抗體，造成供者特異性抗體假陰性。其次純化抗原法包被的抗原在表達(dá)過程中不同系統(tǒng)表達(dá)的蛋白在三維構(gòu)象和表達(dá)后修飾會有很大的不同，以及后續(xù)抗原在純化、包被過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)變性都會導(dǎo)致其發(fā)生假陽性。因此純化原法檢測為非真實(shí)dsa，同時由于型別覆蓋有限，無法避免假陰和假陽風(fēng)險。
3、細(xì)胞學(xué)檢測dsa為真實(shí)的dsa，目前傳統(tǒng)方法為淋巴細(xì)胞毒交叉檢測cdc-xm，此檢測靈敏度低，很多中心的實(shí)踐結(jié)果顯示移植前cdc的陽性檢出率很低，絕大多數(shù)低于5%，甚至有的中心從未檢出陽性結(jié)果。此方法的局限性主要有：1、淋巴細(xì)胞表面抗原相比微球少兩個數(shù)量級，靈敏度低；2、使用顯微鏡對細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞死亡計數(shù)，參與計數(shù)細(xì)胞數(shù)量少，有一定偏差，靈敏度低；3、僅檢測補(bǔ)體依賴的抗體，靈敏度低；4、目前補(bǔ)體缺乏標(biāo)準(zhǔn)品，不同批次活性偏差大，影響檢測結(jié)果。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本申請實(shí)施例的目的在于提供了一種非診斷目的的供者特異性抗體的檢測方法，旨在解決傳統(tǒng)淋巴細(xì)胞毒交叉檢測方法存在檢測靈敏度低的問題。
2、本申請實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種供者特異性抗體的檢測方法，包括：
3、用淋巴分離液分離出供體外周血的單個核細(xì)胞，與受體血漿、hla抗體陰性質(zhì)控品和hla抗體陽性質(zhì)控品進(jìn)行混合孵育，得第一混合液；
4、對第一混合液進(jìn)行洗滌、離心處理，在所得細(xì)胞沉淀層中依次加入二抗goatanti-igg-fitc、cd3/cd19/cd45混合抗體進(jìn)行避光孵育，得第二混合液；
5、對第二混合液進(jìn)行洗滌、離心處理，所得沉淀層中加入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行混懸，基于流式細(xì)胞術(shù)平臺進(jìn)行供者特異性抗體的檢測。
6、其中，首先制備hla抗體陰性和陽性質(zhì)控品并進(jìn)行驗證。hla抗體陰性質(zhì)控品通過混合健康男性人群血清并通過抗體檢測驗證不含有hla抗體后得到。
7、hla抗體陽性質(zhì)控品用小鼠抗體w6/32和f3.3的可變部分和人抗體c-gamma1和c-kappa的恒定部分設(shè)計了兩種嵌合單克隆抗體(moabs)。兩種嵌合moabs分別對hla?-?i類和hla?-?ii類公共表位具有特異性，抗i類moab識別迄今為止檢測的所有hla?i類，抗ii類moab識別dq2亞群的所有hla-dr,?dp和dq抗原。
8、本檢測使用hla抗體陰、陽性質(zhì)控品監(jiān)測反應(yīng)體系，并用hla抗體陰性質(zhì)控品作為基底對dsa陽性閾值做出判斷，通過驗證，閾值定為1.3，首先hla抗體陽性質(zhì)控品和hla抗體陰性質(zhì)控品的平均熒光強(qiáng)度比值要求＞1.3，否則判定為失控，隨后計算受體血清和陰性質(zhì)控的平均熒光強(qiáng)度比值，結(jié)果大于閾值1.3判斷為陽性，結(jié)果小于閾值1.3判斷為陰性。
9、本申請實(shí)施例提供的供者特異性抗體檢測，基于流式細(xì)胞術(shù)平臺，用供者的細(xì)胞與受者的血清反應(yīng)后，加入流式抗體即可快速的檢測出受體體內(nèi)是否存在供者特異性抗體，與純化抗原法相比檢測出的為真實(shí)dsa，避免假陰性和假陽性；與傳統(tǒng)的cdc技術(shù)相比，不需要補(bǔ)體結(jié)合，因此耗時短，靈敏度高，實(shí)驗檢出的抗體是所有能與靶細(xì)胞表面抗原發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的抗體，既包括能激活補(bǔ)體的抗體，也包括不能激活補(bǔ)體的抗體，靈敏度高。
10、本申請實(shí)施例的技術(shù)體系包含hla抗體陰、陽對照，用于監(jiān)測檢測體系的穩(wěn)定性，保障檢測結(jié)果的正確性，同時hla抗體陰性質(zhì)控品作為基底對dsa陽性閾值做出判斷。dsa檢測臨床實(shí)驗室通常采用陽性血清樣本對hla檢測試劑盒與檢測過程進(jìn)行質(zhì)控，來源受限，只能質(zhì)控少數(shù)hla型別，無法起到穩(wěn)定有效監(jiān)控作用，導(dǎo)致流式交叉配型檢測無法在臨床使用。本申請實(shí)施例使用的陽性質(zhì)控品為針對經(jīng)典i類hla基因座a，b，cw所有基因型抗原的泛型別hla抗體anti-hla?class?ⅰ?ctrl，針對經(jīng)典ii類hla基因座dr、dp、dq所有基因型抗原的泛型別hla抗體anti-hla?class?ⅱ?ctrl。上述兩個質(zhì)控抗體都是嵌合單克隆抗體，高變區(qū)分別針對hla?ⅰ類和hla?ⅱ類公共表位，fc區(qū)域為人源igg抗體，可以與很好的質(zhì)控hla抗體。hla?class?ⅰ?抗體質(zhì)控品可以與所有hla-i類抗原反應(yīng)（a、b、cw基因座），并且與ii類hla無反應(yīng)；hla?class?ii抗體質(zhì)控品可以與所有hla-ii類抗原反應(yīng)(dr、dp、dq基因座)，并且與ⅰ類無交叉反應(yīng)，上述hla抗體質(zhì)控品作為流式交叉配型標(biāo)準(zhǔn)化控制。
1.一種供者特異性抗體的檢測方法，其特征在于，包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的供者特異性抗體的檢測方法，其特征在于，所述hla抗體陰性質(zhì)控品通過混合健康男性人群血清并通過抗體檢測驗證不含有hla抗體后得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的供者特異性抗體的檢測方法，其特征在于，所述hla抗體陽性質(zhì)控品用小鼠抗體w6/32和f3.3的可變部分和人抗體c-gamma1和c-kappa的恒定部分設(shè)計了兩種嵌合單克隆抗體，兩種嵌合單克隆抗體分別對hla?-?i類和hla?-?ii類公共表位具有特異性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的供者特異性抗體的檢測方法，其特征在于，所述用淋巴分離液分離出供體外周血的單個核細(xì)胞，與受體血漿、hla抗體陰性質(zhì)控品和hla抗體陽性質(zhì)控品進(jìn)行混合孵育，得第一混合液的步驟，包括：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的供者特異性抗體的檢測方法，其特征在于，所述用淋巴分離液分離出供體外周血的單個核細(xì)胞，與受體血漿、hla抗體陰性質(zhì)控品和hla抗體陽性質(zhì)控品進(jìn)行混合孵育，得第一混合液的步驟，包括：
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的供者特異性抗體的檢測方法，其特征在于，所述對第一混合液進(jìn)行洗滌、離心處理，在所得細(xì)胞沉淀層中依次加入二抗goat?anti-igg-fitc、cd3/cd19/cd45混合抗體進(jìn)行避光孵育，得第二混合液的步驟，包括：
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的供者特異性抗體的檢測方法，其特征在于，所述對第二混合液進(jìn)行洗滌、離心處理，所得沉淀層中加入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行混懸，基于流式細(xì)胞術(shù)平臺進(jìn)行供者特異性抗體的檢測的步驟，包括：
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的供者特異性抗體的檢測方法，其特征在于，使用hla抗體陰性質(zhì)控品和hla抗體陽性質(zhì)控品監(jiān)測反應(yīng)體系，并用hla抗體陰性質(zhì)控品作為基底對dsa陽性閾值做出判斷，閾值為1.3，首先hla抗體陽性質(zhì)控品和hla抗體陰性質(zhì)控品的平均熒光強(qiáng)度比值要求＞1.3，否則判定為失控，隨后計算受體血清和hla抗體陰性質(zhì)控品的平均熒光強(qiáng)度比值，結(jié)果大于閾值判斷為陽性，結(jié)果小于閾值判斷為陰性。