背景技術：

1、rna測序已成為轉錄組分析的標準方法。與其它方法相比，其提供了轉錄本及其異構體的水平和多樣性的精確得多的測量。當轉錄本的末端序列未知時，或者當測序文庫由非常有限的量的rna材料(例如來自單細胞的總rna)制備時，魯棒的全長cdna合成和銜接子添加對于從所研究的轉錄組中產生具有代表性的無偏差的核酸材料源至關重要。在這種情況下，已利用逆轉錄酶(rt)模板轉換反應來同時地富集全長cdna并在第一鏈合成過程中向cdna分子的5’端和3’端添加兩個不同的銜接子，這克服了基于連接的方法的許多缺點。利用模板轉換的單細胞應用取決于逆轉錄和模板轉換反應的效率和特異性。由于rna輸入量極低，來自模板轉換寡核苷酸(template?switching?oligo)的非特異性逆轉錄的產物和模板轉換寡核苷酸多聯化(concatemerization)主導測序文庫，從而限制了該方法的應用。

2、因此，本領域需要改善的組合物以提高基于模板轉換的rna-seq文庫制備的特異性和產量。本發明解決了這一未滿足的需求。

技術實現思路

1、本公開的特征在于模板轉換寡核苷酸(template?switching?oligonucleotides，tso)和包含該模板轉換寡核苷酸的組合物、及其相關使用方法。在一個實施方案中，模板轉換寡核苷酸(tso)包含dna核苷酸序列、rna核苷酸序列、修飾的核苷酸序列或雜合dna-rna序列。在實施方案中，tso可通過與非模板化核苷酸、例如添加至目標核酸分子的5’端的非模板化核苷酸進行堿基配對而退火。在實施方案中，非模板化核苷酸通過逆轉錄酶添加至目標核酸。在實施方案中，tso還包含3’端修飾和5’端修飾中的至少一者。

2、在實施方案中，tso包含3’端修飾。在實施方案中，3’端修飾可為去除3’羥基的修飾或阻斷3’羥基的修飾。在一個實施方案中，tso包含選自由以下組成的組的3’端修飾：3’ddt、3’ddu、3’反向dt、3’c3間隔子、3’氨基、被高碘酸鹽氧化的3’ru、3’磷酸化、3’氟代、3’醛、3’羧酸或羧酸酯(carboxylate)、3’硫醇基(thiol)、3’o-甲基、3’疊氮基(azido)、3’炔烴、3’烯烴、3’(ch2)n-x(x＝h、och3、ch3、sh、nh2、oh等；n≥1)和3’(ch2ch2o)n(n≥1)。

3、在實施方案中，tso包含5’端修飾。在一個實施方案中，5’端用化學基團修飾以減少或實質上阻斷多聯化。在一個實施方案中，5’端用選自由以下組成的組的化學基團修飾：三苯甲基、trebbler、樹枝狀高分子、生物素、熒光染料、rox?nhs酯、(ch2)n(n≥1)長間隔子(spacer)、棕櫚酸亞磷酰胺(palmitate?phosphoramidite)、3-氰基乙烯基咔唑亞磷酰胺、膽固醇基和補骨脂素。

4、在一個實施方案中，5’端包含至少10、9、8、7、6、5、4、3或2個連續的脫堿基位點(abasic?site)。在一個實施方案中，5’端包含至少10個連續的脫堿基位點。在一個實施方案中，5’端包含至少8個連續的脫堿基位點。在一個實施方案中，5’端包含至少6個連續的脫堿基位點。在一個實施方案中，5’端包含至少5個連續的脫堿基位點。在一個實施方案中，5’端包含至少4個連續的脫堿基位點。在一個實施方案中，5’端包含至少3個連續的脫堿基位點。在一個實施方案中，5’端包含至少2個連續的脫堿基位點。

5、在一個實施方案中，5’端包含至少一個非天然核苷酸或核苷酸類似物。在一個實施方案中，在5’端的核苷酸是非天然核苷酸或核苷酸類似物。在一個實施方案中，tso在5’端包含至少一個異脫氧胞嘧啶(iso-dc)、異脫氧鳥苷(iso-dg)或者iso-dc和iso-dg的組合。

6、在一個實施方案中，tso包含至少一種3’端修飾和至少一種5’端修飾。

7、在一個實施方案中，本公開涉及一種逆轉錄(rt)引物，其包含dna核苷酸序列、rna核苷酸序列、修飾的核苷酸序列或雜合dna-rna序列，其中rt引物包含5’端修飾。在一個實施方案中，5’端用化學基團修飾以阻斷多聯化。在一個實施方案中，5’端用選自由5’trebler和5’三苯甲基組成的組的化學基團修飾。在一個實施方案中，5’端包含至少3個連續的脫堿基位點。在一個實施方案中，在5’端的核苷酸是非天然核苷酸或核苷酸類似物。在一個實施方案中，rt引物在5’端包含至少一個異脫氧胞嘧啶(iso-dc)、異脫氧鳥苷(iso-dg)或者iso-dc和iso-dg的組合。

8、在一個實施方案中，本公開涉及一種從rna模板生成cdna分子的方法，所述方法包括使rna模板與包含dna核苷酸序列、rna核苷酸序列、修飾的核苷酸序列或雜合dna-rna序列的tso接觸，其中tso能夠通過與在通過逆轉錄酶的非模板化添加過程中已添加至目標核酸分子的5’端的非模板化核苷酸進行堿基配對而退火，并且其中tso進一步包含3’端修飾和5’端修飾中的至少一者、逆轉錄(rt)引物和逆轉錄酶。

9、在一個實施方案中，rt引物包含dna核苷酸序列、rna核苷酸序列、修飾的核苷酸序列或雜合dna-rna序列，其中rt引物包含5’端修飾。在一個實施方案中，5’端用三苯甲基、trebbler、樹枝狀高分子、生物素、熒光染料、rox?nhs酯、(ch2)n(n≥1)長間隔子、棕櫚酸亞磷酰胺、3-氰基乙烯基咔唑亞磷酰胺、膽固醇基或補骨脂素修飾。

10、在一個實施方案中，逆轉錄酶是marathonrt或其變體、莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶(moloney?murine?leukemia?virus?reverse?transcriptase)(mmlv?rt)或其變體、鳥類成髓細胞性白血病病毒逆轉錄酶(avian?myeloblastosis?virus?reversetranscriptase)(amv?rt)或其變體、hiv逆轉錄酶(hiv?rt)或其變體、家蠶(bombyx?mori)r2rna元件逆轉錄酶(r2rt)或其變體、或者tgirttm或其變體。

11、在一個實施方案中，方法包括在rt-pcr、qrt-pcr、用于rna結構映射的毛細管電泳(ce)、轉錄組分析、細胞內測序、下一代rna測序(rna-seq)、納米孔測序、pacbio測序、零模式波導測序、cdna文庫合成或cdna合成測定、或其任意組合中。

12、在一個實施方案中，本發明涉及一種用于從rna模板生成cdna分子的逆轉錄測定，方法包括使rna模板與包含dna核苷酸序列、rna核苷酸序列、修飾的核苷酸序列或雜交dna-rna序列的tso接觸，其中tso能夠通過與在通過逆轉錄酶的非模板化添加過程中已添加至目標核酸分子的5’端的非模板化核苷酸進行堿基配對而退火，并且其中tso進一步包含3’端修飾和5’端修飾中的至少一者、逆轉錄(rt)引物和逆轉錄酶。

13、在一個實施方案中，rt引物選自由dna引物、rna引物和包含至少一個修飾的寡核苷酸的引物組成的組。

14、在一個實施方案中，逆轉錄酶是marathonrt或其變體、莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶(mmlv?rt)或其變體、鳥類成髓細胞性白血病病毒逆轉錄酶(amv?rt)或其變體、hiv逆轉錄酶(hiv?rt)或其變體、家蠶r2rna元件逆轉錄酶(r2rt)或其變體、或者tgirttm或其變體。

15、在一個實施方案中，逆轉錄在包含peg8000的緩沖液中進行。在一個實施方案中，逆轉錄在包含licl的緩沖液中進行。

16、在一個實施方案中，本發明涉及一種用于進行從rna模板生成cdna分子的測定的試劑盒，方法包括使rna模板與包含dna核苷酸序列、rna核苷酸序列、修飾的核苷酸序列或雜合dna-rna序列的tso接觸，其中tso能夠通過與在通過逆轉錄酶的非模板化添加過程中已添加至目標核酸分子的5’端的非模板化核苷酸進行堿基配對而退火，并且其中tso進一步包含3’端修飾和5’端修飾中的至少一者、逆轉錄(rt)引物和逆轉錄酶。

17、在一個實施方案中，rt引物是dna引物、rna引物或包含至少一個修飾的寡核苷酸的引物。

18、在一個實施方案中，逆轉錄酶是marathonrt或其變體、莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶(mmlv?rt)或其變體、鳥類成髓細胞性白血病病毒逆轉錄酶(amv?rt)或其變體、hiv逆轉錄酶(hiv?rt)或其變體、家蠶r2rna元件逆轉錄酶(r2rt)或其變體、以及tgirttm或其變體。

19、在一個實施方案中，試劑盒包含含有peg8000的緩沖液。在一個實施方案中，試劑盒包含含有licl的緩沖液。

20、在一個實施方案中，本發明涉及一種模板轉換寡核苷酸(tso)，其包含：

21、(i)dna核苷酸序列、rna核苷酸序列或雜合dna-rna序列；和

22、(ii)3’端修飾和5’端修飾中的至少一者。

23、在一個實施方案中，tso包含3’端修飾。在一個實施方案中，tso包含5’端修飾。在一個實施方案中，tso包含3’端修飾和5’端修飾兩者。

24、在一個實施方案中，3’端修飾是核苷酸糖修飾或核堿基修飾。

25、在一個實施方案中，3’端修飾是去除3’羥基的修飾或阻斷3’羥基的修飾。

26、在一個實施方案中，3’端修飾是3’ddt、3’ddu、3’反向dt、3’c3間隔子、3’氨基、被高碘酸鹽氧化的3’ru、3’磷酸化、3’氟代、3’醛、3’羧酸或羧酸酯、3’硫醇基、3’o-甲基、3’疊氮基、3’炔烴、3’烯烴、3’(ch2)n-x(x＝h、och3、ch3、sh、nh2、oh等；n≥1)或3’(ch2ch2o)n(n≥1)。

27、在一個實施方案中，5’端修飾是核苷酸糖修飾或核堿基修飾。

28、在一個實施方案中，5’端修飾包含三苯甲基、trebbler、樹枝狀高分子、生物素、熒光染料、rox?nhs酯、(ch2)n(n≥1)長間隔子、棕櫚酸亞磷酰胺、3-氰基乙烯基咔唑亞磷酰胺、膽固醇基或補骨脂素。

29、在一個實施方案中，3’端修飾是去除3’羥基的修飾或阻斷3’羥基的修飾。

30、在一個實施方案中，5’端包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個連續的脫堿基位點。在一個實施方案中，5’端包含至少5個連續的脫堿基位點。在一個實施方案中，5’端包含至少3個連續的脫堿基位點。

31、在一個實施方案中，5’端包含至少一個非天然核苷酸或核苷酸類似物。

32、在一個實施方案中，tso在5’端包含至少一個異脫氧胞嘧啶(iso-dc)、異脫氧鳥苷(iso-dg)或者iso-dc和iso-dg的組合。

33、在一個實施方案中，本發明涉及一種減少模板轉換寡核苷酸(tso)的多聯化的方法，所述方法包括提供包含tso、逆轉錄(rt)引物和逆轉錄酶的反應混合物，

34、其中tso包含：

35、(i)3’端修飾；和/或

36、(ii)5’端修飾。

37、在一個實施方案中，多聯化減少例如根據參考標準的約1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％。

38、在一個實施方案中，3’端修飾是3’ddt、3’ddu、3’反向dt、3’c3間隔子、3’氨基、被高碘酸鹽氧化的3’ru、3’磷酸化、3’氟代、3’醛、3’羧酸或羧酸酯、3’硫醇基、3’o-甲基、3’疊氮基、3’炔烴、3’烯烴、3’(ch2)n-x(x＝h、och3、ch3、sh、nh2、oh等；n≥1)或3’(ch2ch2o)n(n≥1)。

39、在一個實施方案中，tso包含三苯甲基、trebbler、樹枝狀高分子、生物素、熒光染料、rox?nhs酯、(ch2)n(n≥1)長間隔子、棕櫚酸亞磷酰胺、3-氰基乙烯基咔唑亞磷酰胺、膽固醇基或補骨脂素的5’端修飾。

40、在一個實施方案中，tso的5’端包含至少3個連續的脫堿基位點。

41、在一個實施方案中，tso在5’端包含至少一個異脫氧胞嘧啶(iso-dc)、異脫氧鳥苷(iso-dg)或者iso-dc和iso-dg的組合。

42、在一個實施方案中，tso包含seq?id?no：3。

43、在一個實施方案中，rt引物包含seq?id?no：2。

44、在一個實施方案中，本發明涉及一種減少來自模板轉換寡核苷酸(tso)的非特異性逆轉錄的方法，所述方法包括提供包含tso、逆轉錄(rt)引物和逆轉錄酶的反應混合物，

45、其中tso包含：

46、(i)3’端修飾；和/或

47、(ii)5’端修飾。

48、在一個實施方案中，多聯化減少例如根據參考標準的約1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％。

49、在一個實施方案中，3’端修飾是3’ddt、3’ddu、3’反向dt、3’c3間隔子、3’氨基、被高碘酸鹽氧化的3’ru、3’磷酸化、3’氟代、3’醛、3’羧酸或羧酸酯、3’硫醇基、3’o-甲基、3’疊氮基、3’炔烴、3’烯烴、3’(ch2)n-x(x＝h、och3、ch3、sh、nh2、oh等；n≥1)或3’(ch2ch2o)n(n≥1)。

50、在一個實施方案中，tso包含三苯甲基、trebbler、樹枝狀高分子、生物素、熒光染料、rox?nhs酯、(ch2)n(n≥1)長間隔子、棕櫚酸亞磷酰胺、3-氰基乙烯基咔唑亞磷酰胺、膽固醇基或補骨脂素的5’端修飾。

51、在一個實施方案中，tso的5’端包含至少3個連續的脫堿基位點。

52、在一個實施方案中，tso在5’端包含至少一個異脫氧胞嘧啶(iso-dc)、異脫氧鳥苷(iso-dg)或者iso-dc和iso-dg的組合。

53、在一個實施方案中，tso包含seq?id?no：3。

54、在一個實施方案中，rt引物包含seq?id?no：2。

55、在一個實施方案中，本發明涉及一種增加rna-seq文庫中目標多核苷酸序列的產量的方法，所述方法包括提供包含tso、逆轉錄(rt)引物和逆轉錄酶的反應混合物，

56、其中tso包含：

57、(i)3’端修飾；和/或

58、(ii)5’端修飾。

59、在一個實施方案中，多聯化減少例如根據參考標準的約1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％。

60、在一個實施方案中，3’端修飾是3’ddt、3’ddu、3’反向dt、3’c3間隔子、3’氨基、被高碘酸鹽氧化的3’ru、3’磷酸化、3’氟代、3’醛、3’羧酸或羧酸酯、3’硫醇基、3’o-甲基、3’疊氮基、3’炔烴、3’烯烴、3’(ch2)n-x(x＝h、och3、ch3、sh、nh2、oh等；n≥1)或3’(ch2ch2o)n(n≥1)。

61、在一個實施方案中，tso包含三苯甲基、trebbler、樹枝狀高分子、生物素、熒光染料、rox?nhs酯、(ch2)n(n≥1)長間隔子、棕櫚酸亞磷酰胺、3-氰基乙烯基咔唑亞磷酰胺、膽固醇基或補骨脂素的5’端修飾。

62、在一個實施方案中，tso的5’端包含至少3個連續的脫堿基位點。

63、在一個實施方案中，tso在5’端包含至少一個異脫氧胞嘧啶(iso-dc)、異脫氧鳥苷(iso-dg)或者iso-dc和iso-dg的組合。

64、在一個實施方案中，tso包含seq?id?no：3。

65、在一個實施方案中，rt引物包含seq?id?no：2。

66、在一個實施方案中，本發明涉及一種增加rna-seq文庫的特異性的方法，所述方法包括提供包含tso、逆轉錄(rt)引物和逆轉錄酶的反應混合物，

67、其中tso包含：

68、(i)3’端修飾；和/或

69、(ii)5’端修飾。

70、在一個實施方案中，多聯化減少例如根據參考標準的約1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％。

71、在一個實施方案中，3’端修飾是3’ddt、3’ddu、3’反向dt、3’c3間隔子、3’氨基、被高碘酸鹽氧化的3’ru、3’磷酸化、3’氟代、3’醛、3’羧酸或羧酸酯、3’硫醇基、3’o-甲基、3’疊氮基、3’炔烴、3’烯烴、3’(ch2)n-x(x＝h、och3、ch3、sh、nh2、oh等；n≥1)或3’(ch2ch2o)n(n≥1)。

72、在一個實施方案中，tso包含三苯甲基、trebbler、樹枝狀高分子、生物素、熒光染料、rox?nhs酯、(ch2)n(n≥1)長間隔子、棕櫚酸亞磷酰胺、3-氰基乙烯基咔唑亞磷酰胺、膽固醇基或補骨脂素的5’端修飾。

73、在一個實施方案中，tso的5’端包含至少3個連續的脫堿基位點。

74、在一個實施方案中，tso在5’端包含至少一個異脫氧胞嘧啶(iso-dc)、異脫氧鳥苷(iso-dg)或者iso-dc和iso-dg的組合。

75、在一個實施方案中，tso包含seq?id?no：3。

76、在一個實施方案中，rt引物包含seq?id?no：2。