本發明涉及發酵肉制品，具體領域為一種腸膜明串珠菌、重組表達亞鐵螯合酶的方法和應用。

背景技術：

1、色澤是評估肉制品品質的直接感官指標。肉制品長期放置會導致肌紅蛋白(mb)的fe2+被氧化fe3+，轉化成灰棕色的高鐵肌紅蛋白。傳統肉制品加工廣泛采用亞硝酸鹽來改善肉制品的色澤，通過添加亞硝酸鹽產生一氧化氮，一氧化氮與肌紅蛋白結合生成鮮紅色的亞硝基肌紅蛋白，使肉制品維持在相對穩定的理想色澤，但亞硝酸鹽會產生強致癌物——n-亞硝胺化合物，并且可能會導致一氧化氮中毒。為提高肉制品安全性及對天然清潔標簽的追求，研究者迫切尋求替代亞硝酸鹽的發色方法。

2、目前，替代亞硝酸鹽的方法最廣泛的研究是利用微生物發色，這些微生物主要包括乳酸菌、葡萄球菌和微球菌等。cn109868251a公開了一株具有發色作用的肉葡萄球菌b1-2。該發色劑為肉葡萄球菌，通過液體培養基培養制成凍干型發酵劑，在薩拉米香腸中的接種量為0.01％-0.05％。使用時，在整個發酵期接種菌株組與添加60ppm的亞硝酸鹽組色度值無顯著差異，可代替亞硝酸鹽在香腸中的發色作用。cn109868251a通過使用一種具有一氧化氮合酶的肉葡萄球菌，其通過代謝產生的一氧化氮將肌紅蛋白轉化為亞硝基肌紅蛋白，從而顯著改善肉制品的色澤。

3、cn110800913a公開了一種替代加工肉制品中亞硝酸鹽的發色劑，其中一種發色劑為凝固酶陰性葡萄球菌的菌粉劑或菌懸液，在肉制品加工中的接種量為106～107cfu/g肉；另一種發色劑由上述菌粉劑或菌懸液和l-精氨酸組成，l-精氨酸添加量為肉制品質量的0.6％～1.2％。所述菌粉劑或菌懸液通過液體培養基培養制得。具有一氧化氮合酶的凝固酶陰性葡萄球菌可在肉制品加工中代謝產生一氧化氮，從而形成紅色的亞硝基肌紅蛋白，使加工肉制品呈現紅色澤；添加l-精氨酸，可以進一步提升發色效果。

4、雖然上述微生物在代謝過程中產生一氧化氮與肌紅蛋白結合生成亞硝基肌紅蛋白，但微生物產一氧化氮能力不足，導致肉制品中亞硝基肌紅蛋白含量遠低于添加亞硝酸鹽的肉制品，肉品發色效果遠弱于添加亞硝酸鹽的發色效果。而鋅原卟啉則是一種比亞硝基肌紅蛋白更具光熱穩定性的色素。鋅原卟啉(zinc?protoporphyrin,znpp)是一種天然金屬卟啉色素，其結構與血紅素相似，但卟啉環中心為zn2+，在光、熱及低氧環境中均表現出更優異的穩定性。znpp的形成主要通過兩種途徑：一是zn2+直接插入原卟啉(ppix)生成znpp；二是由亞鐵螯合酶(ferrochelatase,fech)催化，先將血紅素中的fe2+移除，隨后插入zn2+。fech廣泛存在于自然界中，包括植物、動物和微生物等多種生物體內。

5、目前，關于微生物生成znpp的研究主要集中無亞硝酸鹽腌制火腿加工過程中znpp的生成規律以及產生znpp菌株的篩選上，對微生物中fech的研究較少。

技術實現思路

1、本發明的目的在于提供一種腸膜明串珠菌及其重組表達亞鐵螯合酶的方法和應用。

2、本發明研究團隊首次在過期巴氏殺菌火腿中檢測到了大量znpp，并系統探究了影響znpp生成的關鍵因素，初步確定微生物是znpp生成的重要驅動因素。基于此，本發明篩選得到了具有發色能力的腸膜明串珠菌lms.hfut，并通過體外重組表達fech，對其分離純化以提高產量，最終將其添加到肉制品中，可以達到替代亞硝酸鹽的護色作用，提高肉品安全性。

3、具體而言，本發明提供如下技術方案：

4、腸膜明串珠菌(leuconostoc?mesenteroides)lms.hfut，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2023年2月24日，生物保藏編號為cctcc?no：m2023193。

5、采用上述腸膜明串珠菌重組表達fech的方法，包括以下步驟：

6、(1)dna提取：將腸膜明串珠菌lms.hfut菌株在mrs液體培養基中培養至第三代并以1.0％v/v的接種量接種至液體培養基，然后以150～200rpm速度在37℃培養12～16h；隨后設計引物進行pcr擴增，所述引物序列如seq?id?no:1-10所示；pcr反應體系：taqpcrmaster?mix?25μl，2μl?dna，1μl正向和反向引物，21μl滅菌雙蒸水；梯度pcr反應條件為：95℃下初始變性20min；34個循環：95℃30s，56℃30s，72℃60s；最后在72℃延伸5min；擴增后，使用2％瓊脂糖凝膠電泳觀察pcr產物及其大小。

7、(2)制備感受態細胞：挑取bl21單菌落接種于lb液體培養基中，于37℃搖床中培養12～16h；將培養后的菌液按照1％v/v接種于lb液體培養基中，繼續在37℃搖床中培養至od600為0.4；將菌液在超凈臺中分裝至離心管中，在冰上靜置20min；冰浴結束后，以4℃，4000g離心5min，去除上清；向沉淀中加入100μl預冷的0.1m?cacl2溶液，輕輕吹打重懸液體，再次冰浴20min，隨后再次以4℃，4000g離心5min，棄去上清；向沉淀中再次加入100μl預冷的0.1m?cacl2溶液，輕輕吹打重懸液體，感受態細胞制備完成；保存在-80℃冰箱備用。

8、(3)感受態細胞轉化：取出制備好的bl21感受態細胞于冰上，加入目的基因與pqe-80l載體連接的產物pqe-80l-fech，冰盒中靜置30min；隨后將其置于42℃水浴熱激90s，再立即取出于冰上冷卻3min，接著加入900μl?37℃預熱的無抗性lb液體培養基，輕輕吹打混勻，放入37℃恒溫搖床中復蘇30min；復蘇后，吸取100μl菌液加至含100μg/ml?amp的lb固體平板中，在37℃恒溫箱中培養12～18h。

9、(4)重組fech的誘導表達：從含有重組菌至lb液體培養基中，于37℃、170～220rpm條件下培養8～10h，得到種子液；將1％v/v的種子液接種至lb培養基中，在37℃、170～220rpm條件下培養；當菌體濃度od600達到0.6時，加入終濃度為0.5mm?iptg進行誘導；繼續在37℃、150～200rpm條件下發酵12～16h，收集發酵液，離心，上清液即為胞外重組fech粗酶液。

10、(5)重組fech的收集和純化：誘導結束后，將發酵液在10000g、4℃條件下離心10～15min，收集菌體沉淀；隨后使用tris-hcl緩沖液重懸菌體，再次離心，重復此操作兩次以洗滌菌體；然后對洗滌后的菌體重懸液進行冰浴超聲破碎，參數設置為：功率200～300w，工作時間2～4s，間隔時間3～5s，工作時間10～15min，循環2～3次；

11、在超聲破碎至菌液變得澄清后，4℃條件下12000g離心10～15min，收集上清液，即粗酶液；采用鎳親和層析法對獲得的粗酶液進行純化；清洗和平衡含鎳填料的重力鎳柱后，用粗酶液流穿三次，隨后使用tris-hcl緩沖液對負載fech的鎳柱進行洗脫，收集洗脫液。

12、(6)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析重組酶的純度和分子量：將粗酶液及純化酶與蛋白上樣緩沖液混合均勻，隨后在沸水浴中加熱2～5min后進行上樣；制備濃縮膠和分離膠，設置電泳電壓為70～100v；實驗結束后，將凝膠浸入考馬斯亮藍染色液中染色1h，然后在脫色液中震蕩脫色，直至凝膠背景藍色褪去，最后使用凝膠成像系統拍照，記錄電泳結果。

13、本發明上述腸膜明串珠菌重組表達fech的方法制得的fech可以用于制備肉品發色劑，將其應用于發酵香腸中，可以替代亞硝酸鹽的發色作用。

14、與現有技術相比，本發明的有益效果是：

15、本發明研究團隊篩選出了產znpp的優勢菌株——腸膜明串珠菌lms.hfut，并揭示了其發色機制。基于此，本發明通過體外重組表達fech，并對其分離純化以提高產量，最終將其應用于發酵香腸中，以替代亞硝酸鹽的發色作用，來控制香腸發酵過程的品質并提高安全性。

16、生物保藏信息

17、腸膜明串珠菌lms.hfut，分類命名為leuconostoc?mesenteroides，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏機構簡稱：cctcc，保藏地址：湖北省武漢市武昌區八一路299號武漢大學校內，保藏日期為2023年2月24日，生物保藏編號為cctcc?no：m2023193。