本公開總體上涉及抗體癌癥療法的，并且更具體地涉及雙表位四價抗體。

背景技術：

1、多形性成膠質細胞瘤是一種侵襲性癌癥，占起源于大腦的惡性腫瘤的大多數，并且預后差，診斷后的平均生存期為14-15個月。1大部分成膠質細胞瘤病例(34-63％)涉及egfr基因的擴增。2除了野生型egfr蛋白的過表達之外，egfr的突變形式出現在63-75％的病例中，其中最常見的突變被稱為egfrviii，出現在25-64％的病例中。2在結構上，egfrviii突變導致蛋白質胞外結構域的267個殘基缺失，由于受體的胞吞作用效率較低，其在功能上可能誘導組成型信號傳導。2這些變化使得攜帶egfrviii的腫瘤表現出增殖增加、血管生成增加和細胞凋亡減少。2除了與多形性成膠質細胞瘤關聯之外，野生型egfr和突變型egfrviii也可以在其它類型的實體瘤中過表達，包括卵巢癌、乳腺癌和肺癌。2

2、幾種靶向egfr的抗體，包括西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)和耐昔妥珠單抗(necitumumab)，已經被fda批準用于治療上皮腫瘤。尼妥珠單抗(nimotuzumab)在幾個國家也被批準用于治療實體瘤。與西妥昔單抗或帕尼單抗相比，尼妥珠單抗對egfr的較低親和力可能幫助解釋其皮膚毒性降低的原因。3同時，已經在臨床試驗中評價了特異性靶向突變型egfrviii的基于抗體的療法，包括單克隆抗體迪妥昔珠單抗(depatuxizumab)(i期)和抗體-藥物綴合物瑪汀-迪妥昔珠單抗(depatuxizumabmafodotin)(3期)。特別地，egfrviii靶向adc的3期試驗在未達到新診斷的成膠質細胞瘤患者的總體生存期的主要終點后被停止。4靶向egfrviii和cd3的t細胞接合物也已經進行了臨床前評價，進一步強調了egfrviii作為治療靶點的前景。5,6雖然egfrviii靶向療法不會很快投入使用，但目前尚沒有同時靶向表達致癌egfr的腫瘤細胞的單一療法，這些致癌egfr包括過度表達(wt)和突變egfr(viii)。

3、西妥昔單抗衍生抗體和abt806衍生抗體的潛在缺點在于，這些抗體的可變區是在小鼠中發現的，并且保留了非人序列。已經證明，當與人源化或人抗體相比時，嵌合抗體可能具有增加的免疫原性能力。7另一方面，人源化不僅可以降低免疫原性，而且可以通過使可變區和恒定區更相容來提高抗體的穩定性。8

4、西妥昔單抗對其抗原egfr的高親和力可能導致中靶脫瘤結合。結果，經常觀察到毒性，諸如嚴重的皮膚刺激。同時，以較低親和力結合egfr的尼妥珠單抗似乎具有較少的這些不期望的副作用。9因此，降低抗體如西妥昔單抗的親和力可能是有利的，以便在保留其抗原特異性的同時減少與低表達的健康組織的結合，從而提高治療指數。在雙特異性抗體的情況下，減弱的親和力可用于平衡兩個結合結構域的相對強度，并且有效地優化抗體的總體特異性。

技術實現思路

1、以下
技術實現要素：
僅是說明性的，并不旨在以任何方式進行限制。除了上述說明性方面、實施方案和特征之外，通過參考附圖和以下詳細描述，其它方面、實施方案和特征將變得顯而易見。

2、本公開提供靶向egfr的至少兩個表位的雙表位四價抗體，以及制備和使用該抗體的方法。

3、在一方面，本技術提供了一種對egfr的至少兩個表位具有結合親和力的雙表位四價抗體。該抗體可以包括抗體骨架，其包含具有抗體輕鏈可變(vl)結構域的抗體輕鏈、具有抗體重鏈可變(vh)結構域的抗體重鏈，其中抗體vl結構域和抗體vh結構域形成fab區。該抗體還可以包括具有scfv輕鏈可變(vl)結構域和scfv重鏈可變(vh)結構域的scfv結構域，其中scfv結構域通過結構域間接頭與抗體輕鏈或抗體重鏈的至少一個末端連接。

4、在一個實施方案中，每個scfv結構域具有n末端-vh-接頭-vl-c末端或n末端-vl-接頭-vh-c末端的結構順序。在一個實施方案中，接頭包含具有約20個氨基酸的柔性gs接頭。在一個實施方案中，接頭包含氨基酸序列(gly-gly-gly-gly-ser)m，并且其中m是至少3的整數。在一個實施方案中，m是4。

5、在一個實施方案中，結構域間接頭包含約10個至約30個氨基酸。在一個實施方案中，結構域間接頭包含氨基酸序列(gly-gly-gly-gly-ser)m，并且其中m是至少2的整數。在一個實施方案中，m是2至6的整數。

6、在一個實施方案中，egfr的兩個表位包含egfr野生型(egfrwt)表位和egfrviii表位，并且雙表位四價抗體對egfrviii比對egfrwt具有更強的結合親和力。在一個實施方案中，該抗體對egfrwt表位具有第一kd的結合親和力，并且對egfrviii表位具有第二kd的結合親和力，其中第一kd高于第二kd。

7、在一個實施方案中，第一kd不小于1e-11m，并且第二kd不大于1e-06m。在一個實施方案中，第一kd在1e-10m和1e-06m之間，并且第二kd在1e-11m和1e-07m之間。在一個實施方案中，第一kd比第二kd高1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍或70倍。在一個實施方案中，第一kd比第二kd強1.1至1000倍。

8、在一個實施方案中，該抗體具有針對僅攜帶egfrwt的細胞的第一adcc?ec50和針對攜帶egfrwt和egfrviii的細胞的第二adcc?ec50，其中第一adcc?ec50大于第二adccec50。在一個實施方案中，第一adcc?ec50比第二adcc?ec50高1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍。

9、在一個實施方案中，egfrwt表位包含對西妥昔單抗具有結合親和力的表位。在一個實施方案中，egfrviii表位包含對abt-806具有結合親和力的表位。

10、在一個實施方案中，雙表位四價抗體的scfv結構域對egfrwt表位具有結合親和力，并且fab結構域對egfrviii表位具有結合親和力。在一個實施方案中，scfv結構域對egfrviii表位具有結合親和力，并且fab結構域對egfrwt表位具有結合親和力。

11、在一個實施方案中，scfv結構域在其c末端與雙表位四價抗體輕鏈連接。在一個實施方案中，scfv結構域在其n末端與抗體輕鏈連接。在一個實施方案中，scfv結構域在其c末端與抗體重鏈連接。在一個實施方案中，scfv結構域在其n末端與抗體重鏈連接。

12、在一個實施方案中，抗體骨架可以衍生自西妥昔單抗、人源化西妥昔單抗、去成熟化西妥昔單抗或人源化去成熟化西妥昔單抗(即，西妥昔單抗衍生骨架)或者尼妥珠單抗，并且scfv結構域可以包含衍生自abt-806或人源化abt-806的結合結構域。

13、供選擇地，抗體骨架可以衍生自abt-806或人源化abt-806，并且scfv結構域可以包含衍生自西妥昔單抗、人源化西妥昔單抗、去成熟化西妥昔單抗或人源化去成熟化西妥昔單抗或者尼妥珠單抗的結合結構域。

14、在一個實施方案中，人源化abt-806是abt-806v1、v2、v3、v4、v5、v6、v7、v8或v9。

15、西妥昔單抗骨架雙表位四價抗體

16、在一個實施方案中，本技術提供了一種雙表位四價抗體，其中抗體骨架衍生自西妥昔單抗、人源化西妥昔單抗、去成熟化西妥昔單抗或人源化去成熟化西妥昔單抗(即，西妥昔單抗衍生骨架)。在一個實施方案中，scfv結構域包含衍生自abt-806或人源化abt-806的可變區的結合結構域。

17、在一個實施方案中，抗體骨架包含選自vh-y101、vh-y102、vh-d103、vh-y104、vl-n92或其組合的西妥昔單抗去成熟化突變(按順序編號)。在一個實施方案中，西妥昔單抗去成熟化突變(按順序編號)包含vh-y101a、vh-y101w、vh-y102a、vh-d103f、vh-d103w、vh-d103y、vh-y104l、vl-n92f、vl-n92k或其組合。

18、在一個實施方案中，抗體重鏈包含與seq?id?no.1、13、79、97、101、103、105、107、123、127、129、131或133具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗體輕鏈包含與seq?id?no.3、81、83、99、109、125或135具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

19、在一個實施方案中，抗體骨架包含人源化西妥昔單抗。在一個實施方案中，抗體vh結構域包含與seq?id?no.237具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗體vl結構域包含與seq?id?no.239具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

20、在一個實施方案中，抗體骨架包含去成熟化西妥昔單抗。在一個實施方案中，抗體vh結構域包含與seq?id?no.247、251、253、259、261、263、265或267具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗體vl結構域包含與seq?id?no.243或269具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

21、在一個實施方案中，抗體骨架包含人源化去成熟化西妥昔單抗。在一個實施方案中，抗體vh結構域包含與seq?id?no.245、249、255或257具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗體vl結構域包含與seqidno.241具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

22、在一個實施方案中，人源化abt-806是abt-806v1、v2、v3、v4、v5、v6、v7、v8或v9。

23、在一個實施方案中，scfv結構域包含abt-806或人源化abt-806的可變區。

24、在一個實施方案中，scfv?vh結構域包含與seq?id?no.209、225、229或233具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，scfvvl結構域包含與seq?id?no.211、227、231或235具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

25、在一個實施方案中，抗體vh結構域包含seq?id?no.201、237、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265或267的3個互補決定區(cdr)。在一個實施方案中，抗體vl結構域包含seq?id?no.203、239、241、243或269的3個cdr。在一個實施方案中，scfv?vh結構域包含seq?id?no.209的3個cdr。在一個實施方案中，scfv?vl結構域包含seq?id?no.211的3個cdr。

26、在一個實施方案中，雙表位四價抗體包含與seq?id?no.1、3、13、79、81、83、97、99、101、103、105、107、109、123、125、127、129、131、133或135具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

27、abt-806骨架雙表位四價抗體

28、在一個實施方案中，本技術提供了一種雙表位四價抗體，其中抗體骨架衍生自abt0806或人源化abt-806，并且其中scfv結構域包含衍生自西妥昔單抗、人源化西妥昔單抗、去成熟化西妥昔單抗，人源化去成熟化西妥昔單抗的可變區的結合結構域。在一個實施方案中，scfv結構域包含衍生自尼妥珠單抗的結合結構域。

29、在一個實施方案中，抗體重鏈包含與seq?id?no.9、17、19、21、23、25、27、29、31、75、93、113、115、117、119、121、137、139、141、143、145、147或179具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

30、在一個實施方案中，抗體輕鏈包含與seq?id?no.11、33、35、37、39、41、43、77、91、95或111具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

31、在一個實施方案中，抗體骨架包含abt-806，并且其中抗體vh結構域包含與seqidno.209具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案，vl結構域包含與seq?id?no.211具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

32、在一個實施方案中，抗體骨架包含人源化abt-806。在一個實施方案中，抗體vh結構域包含與seq?id?no.225、229或233具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗體vl結構域包含與seq?id?no.227、231或235具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

33、在一個實施方案中，scfv?vh結構域包含與seq?id?no.201、205、237、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265或267具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

34、在一個實施方案中，scfv?vl結構域包含與seq?id?no.203、207、239、241、243或269具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

35、在一個實施方案中，scfv結構域包含衍生自去成熟化西妥昔單抗或人源化去成熟化西妥昔單抗的可變區的結合結構域。在一個實施方案中，去成熟化西妥昔單抗或人源化去成熟化西妥昔單抗包含選自y101、y102、d103、y104、n92及其組合的西妥昔單抗去成熟化突變(按順序編號)。在一個實施方案中，西妥昔單抗去成熟化突變(按順序編號)包含vh-y101、vh-y102、vh-d103、vh-y104、vl-n92或其組合。在一個實施方案中，西妥昔單抗去成熟化突變(按順序編號)包含vh-y101a、vh-y101w、vh-y102a、vh-d103f、vh-d103w、vh-d103y、vh-y104l、vl-n92f、vl-n92k或其組合。

36、在一個實施方案中，雙表位四價抗體vh結構域包含seq?id?no.209的3個互補決定區(cdr)。在一個實施方案中，雙表位四價抗體vl結構域包含seq?id?no.211的3個cdr。在一個實施方案中，scfv?vh結構域包含seq?id?no.201、205、237、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265或267的3個cdr。在一個實施方案中，scfv?vl結構域包含seq?idno.203、207、239、241、243或269的3個cdr。

37、在一個實施方案中，雙表位四價抗體包含與seq?id?no.9、11、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、41、43、75、77、91、93、95、111、113、115、117、119、121、137、139、141、143、145、147或179具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

38、尼妥珠單抗骨架抗體

39、在一個實施方案中，本技術提供了雙表位四價抗體，其中抗體骨架包含尼妥珠單抗，并且其中scfv結構域包含衍生自abt-806或人源化abt-806的可變區的結合結構域。在一個實施方案中，scfv結構域包含abt-806的可變區。

40、在一個實施方案中，抗體重鏈包含與seq?id?no.5、15、45、47、49、51、53、55或85具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

41、在一個實施方案中，抗體輕鏈包含與seq?id?no.7、57、59、61、63、65、67、69、71或73具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

42、在一個實施方案中，抗體vh結構域包含與seq?id?no.205具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

43、在一個實施方案中，抗體vl結構域包含與seq?id?no.207具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

44、在一個實施方案中，scfv?vh結構域包含與seq?id?no.209具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，scfv?vl結構域包含與seqid?no.211具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

45、在一個實施方案中，抗體vh結構域包含seq?id?no.205的3個互補決定區(cdr)。在一個實施方案中，抗體vl結構域包含seq?id?no.207的3個cdr。在一個實施方案中，scfv?vh結構域包含seq?id?no.209的3個cdr。在一個實施方案中，scfv?vl結構域包含seq?idno.211的3個cdr。

46、在一個實施方案中，雙表位四價抗體包含與seq?id?no.5、7、15、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或85具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

47、去成熟化西妥昔單抗單克隆抗體

48、在一方面，本技術提供了一種去成熟化西妥昔單抗單克隆抗體，其包含具有輕鏈可變(vl)結構域的輕鏈和具有重鏈可變(vh)結構域的重鏈，其中vl結構域和vh結構域形成fab區，并且其中單克隆抗體包含選自vh-y101、vh-y102、vh-d103、vh-y104、vl-n92及其組合的西妥昔單抗去成熟化突變(按順序編號)。

49、在一個實施方案中，西妥昔單抗去成熟化突變(按順序編號)包含vh-y101a、vh-y101w、vh-y102a、vh-d103f、vh-d103w、vh-d103y、vh-y104l、vl-n92f、vl-n92k或其組合。

50、在一個實施方案中，去成熟化西妥昔單抗單克隆抗體是非人源化的。

51、在一個實施方案中，抗體vh結構域包含3個互補決定區(cdr)，該cdr具有與seqidno.247、251、253、259、261、263、265或267具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗體vl結構域包含3個cdr，該cdr具有與seq?idno.243或269具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

52、在一個實施方案中，重鏈包含與seq?id?no.1、155、157、159、161、163、165、167或169具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗體vh結構域包含與seq?id?no.247、251、253、259、261、263、265或267具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

53、在一個實施方案中，輕鏈包含與seq?id?no.3、151或153具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，vl結構域包含與seqidno.243或269具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

54、在一個實施方案中，去成熟化西妥昔單抗單克隆抗體是人源化的。

55、在一個實施方案中，抗體vh結構域包含3個互補決定區(cdr)，該cdr具有與seqidno.245、249、255或257具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗體vl結構域包含3個互補決定區(cdr)，該cdr具有與seq?idno.241具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

56、在一個實施方案中，重鏈包含與seq?id?no.123、127、129、131或133具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗體vh結構域包含與seq?id?no.245、249、255或257具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

57、在一個實施方案中，輕鏈包含與seq?id?no.99或109具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗體vl結構域包含與seqid?no.241具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

58、在一個實施方案中，本技術提供了一種多特異性抗體，其包含抗體骨架和至少一個與抗體骨架連接的scfv結構域，其中抗體骨架包含如本文公開的去成熟化西妥昔單抗單克隆抗體。在一個實施方案中，本技術提供了一種多特異性抗體，其包含抗體骨架和至少一個與抗體骨架連接的scfv結構域，其中scfv結構域包含如本文公開的去成熟化西妥昔單抗單克隆抗體的可變區。

59、人源化抗egfrviii單克隆抗體

60、在一方面，本技術提供了一種人源化抗egfrviii單克隆抗體，其包含具有輕鏈可變(vl)結構域的輕鏈和具有重鏈可變(vh)結構域的重鏈，其中vl結構域和vh結構域形成fab區。在一個實施方案中，單克隆抗體是abt0806或人源化abt-806。

61、在一個實施方案中，重鏈包含與seq?id?no.171、149或177具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，輕鏈包含與seq?idno.111、173或175具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，vh結構域包含與seq?id?no.225、229或233具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，vl結構域包含與seqidno.227、231或235具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

62、在一個實施方案中，本技術提供了一種多特異性抗體，其包含抗體骨架和至少一個與抗體骨架連接的scfv結構域，其中抗體骨架包含如本文公開的人源化抗egfrviii單克隆抗體。在一個實施方案中，本技術提供了一種多特異性抗體，其包含抗體骨架和至少一個與抗體骨架連接的scfv結構域，其中scfv包含如本文公開的人源化抗egfrviii的可變區。

63、四價抗體

64、在一方面，本技術提供了一種對egfr具有結合親和力的四價抗體，其包含具有抗體輕鏈可變(vl)結構域的抗體輕鏈、具有抗體重鏈可變(vh)結構域的抗體重鏈，以及具有scfv輕鏈可變(vl)結構域和scfv重鏈可變(vh)結構域的scfv結構域，其中抗體vl結構域和抗體vh結構域形成fab區，其中scfv結構域與抗體輕鏈或抗體重鏈的至少一個末端連接。

65、在一個實施方案中，抗體vh結構域包含具有seq?id?no.201的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗體vl結構域包含具有seq?id?no.203的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗體重鏈包含具有seq?id?no.89的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗體輕鏈包含具有seqidno.3的氨基酸序列。在一個實施方案中，scfv結構域包含具有seq?id?no.203的氨基酸序列的輕鏈可變(vl)結構域。在一個實施方案中，scfv結構域包含具有seq?id?no.201的氨基酸序列的重鏈可變(vh)結構域。

66、在一個實施方案中，抗體重鏈包含與seq?id?no.89具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗體輕鏈包含seq?idno.3。在一個實施方案中，抗體vh包含seq?id?no.201。在一個實施方案中，抗體vl包含seqidno.203。在一個實施方案中，抗體scfv?vh包含seq?id?no.201。在一個實施方案中，抗體scfv?vl包含seq?id?no.203。

67、在一個實施方案中，抗體vh包含seq?id?no.201的3個互補決定區(cdr)。在一個實施方案中，抗體vl包含seq?id?no.203的3個cdr。在一個實施方案中，抗體scfv?vh包含3個cdr：seq?id?no.201。在一個實施方案中，抗體scfv?vl?3個cdr包含seq?idno.203。

68、在一個實施方案中，四價抗體由si-95x42表示，如下面的實施例所示。

69、在另一個實施方案中，本技術提供了一種對egfrviii具有結合親和力的四價抗體，其包含具有抗體輕鏈可變(vl)結構域的抗體輕鏈、具有抗體重鏈可變(vh)結構域的抗體重鏈，以及具有scfv輕鏈可變(vl)結構域和scfv重鏈可變(vh)結構域的scfv結構域，其中抗體vl結構域和抗體vh結構域形成fab區，其中scfv結構域與抗體輕鏈或抗體重鏈的至少一個末端連接。

70、在一個實施方案中，抗體vh結構域包含具有seq?id?no.209的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗體vl結構域包含具有seq?id?no.211的氨基酸序列。

71、在一個實施方案中，抗體重鏈包含具有seq?id?no.87的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗體輕鏈包含具有seq?id?no.11的氨基酸序列。在一個實施方案中，scfv結構域包含具有seq?id?no.211的氨基酸序列的輕鏈可變(vl)結構域。在一個實施方案中，scfv結構域包含具有seq?id?no.209的氨基酸序列的重鏈可變(vh)結構域。

72、在一個實施方案中，抗體重鏈包含seq?id?no.87。在一個實施方案中，抗體輕鏈包含seqid?no.11。在一個實施方案中，抗體vh結構域包含seq?id?no.209。在一個實施方案中，抗體vl結構域包含seq?id?no.211。在一個實施方案中，抗體scfv?vh結構域包含seqidno.209。在一個實施方案中，抗體scfv?vl結構域包含seq?id?no.211。

73、在一個實施方案中，抗體vh結構域包含seq?id?no.209的3個互補決定區(cdr)。在一個實施方案中，抗體vl結構域包含seq?id?no.211的3個cdr。在一個實施方案中，抗體scfv?vh結構域包含seq?id?no.209的3個cdr。在一個實施方案中，抗體scfv?vl結構域包含seq?id?no.211的3個cdr。

74、在一個實施方案中，種內抗體由si-95x41表示，如下面的實施例所示。

75、在另一方面，本技術提供了分離的核酸序列，其編碼如本文公開的雙表位四價抗體、單克隆抗體、四特異性抗體或多特異性抗體。

76、在又一方面，本技術提供了表達載體，其包含如本文公開的核酸序列，其中載體在細胞中表達。

77、在又一方面，本技術提供了宿主細胞，其包含如本文公開的核酸。在一個實施方案中，宿主細胞包含如本文公開的表達載體。在一個實施方案中，宿主細胞是原核細胞或真核細胞。

78、在又一方面，本技術提供了產生如本文公開的抗體的方法。在一個實施方案中，該方法包括培養本文公開的宿主細胞，以便產生所公開的抗體。在一個實施方案中，抗體是雙表位四價抗體。在一個實施方案中，抗體是單克隆抗體。在一個實施方案中，抗體是四特異性抗體。在一個實施方案中，抗體是多特異性抗體。

79、在又一方面，本技術提供了免疫綴合物，其包含如本文公開的雙表位四價抗體和細胞毒性劑。在一個實施方案中，細胞毒性劑包含化療劑、生長抑制劑、毒素或放射性同位素。

80、在又一方面，本技術提供了一種藥物組合物，其包含如本文公開的抗體和藥學上可接受的載體。在一個實施方案中，藥物組合物還包括放射性同位素、放射性核素、毒素、治療劑、化療劑或其組合。在一個實施方案中，抗體是雙表位四價抗體。在一個實施方案中，抗體是單克隆抗體。在一個實施方案中，抗體是四特異性抗體。在一個實施方案中，抗體是多特異性抗體。

81、在又一方面，本技術提供藥物組合物，其包含如本文公開的免疫綴合物和藥學上可接受的載體。

82、在又一方面，本技術提供了治療患有癌癥的受試者的方法，其包括向受試者施用有效量的如本文公開的雙表位四價抗體。在一個實施方案中，癌癥包含表達egfr、egfrviii或兩者的細胞。在一個實施方案中，癌癥包括乳腺癌、結腸直腸癌、胰腺癌、頭頸癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、神經膠質瘤、食道癌、鼻咽癌、腎癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、宮頸癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤。

83、在一個實施方案中，該治療方法還包括共施用有效量的治療劑。在一個實施方案中，治療劑包括抗體、化療劑、酶或其組合。在一個實施方案中，治療劑包括卡培他濱、順鉑、曲妥珠單抗、氟維司群、他莫昔芬、來曲唑、依西美坦、阿那曲唑、氨魯米特、睪內酯、伏羅唑、福美司坦、法倔唑、來曲唑、埃羅替尼、拉法替尼、達沙替尼、吉非替尼、伊馬替尼、帕唑帕尼、拉帕替尼、舒尼替尼、尼羅替尼、索拉非尼、nab-紫杉醇、其衍生物或組合。

84、在一個實施方案中，受試者是人。

85、在又一方面，本技術提供了一種溶液，其包含有效濃度的如本文公開的雙表位四價抗體，其中溶液是受試者的血漿。