本發明涉及生物，具體涉及敲除zm00001d008500基因在提高玉米穗腐病抗性中的應用。

背景技術：

1、基因組編輯是一種對基因組進行定向精確修飾的技術，主要包括鋅指核酸酶(zinc-finger?nucleases，zfns)，類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcriptionactivator-like?effector?nucleases，talens)和規律成簇的間隔短回文重復系統(clustered?regularly?interspaced?short?palindromic?repeats/crispr-associatednuclease，crispr/cas)。crispr/cas12系統是一種基于crispr(成簇規律間隔短回文重復序列)和cas蛋白的基因編輯工具，屬于ⅴ型crispr系統。其特征蛋白為cas12a(也稱為cpf1)，與cas9不同，cas12a系統僅需要一個單一的引導rna(crrna)即可發揮作用。cas12a蛋白具有ruvc結構域，該結構域負責切割靶dna的兩條鏈，從而產生dna雙鏈斷裂。cas12a的切割機制獨特，其在識別靶dna的pam序列后，會在pam上游的特定位置切割靶標鏈，產生5'黏性末端。此外，cas12a在完成靶標鏈切割后，還會激活其非特異性單鏈dna(ssdna)切割活性，這一特性使其在核酸檢測和生物傳感器設計中具有重要應用價值。

2、cas12a系統的組成相對簡單，不需要tracrrna輔助，僅需crrna即可引導cas12a識別并切割靶dna。這種簡化的設計使其在基因組編輯中具有更高的靈活性和操作便利性。近年來，研究人員還開發了更小型化的cas12變體，如cas12f和cas12n，這些變體在靶向編輯方面表現出更高的精度和效率。cas12系統已被廣泛應用于基因組編輯、病原體檢測和生物傳感器開發等領域。

3、與cas9相比，cas12a具有更寬泛的pam序列要求，例如lbcpf1對pam序列的要求與cas9相似，而fncpf1則對pam序列沒有嚴格限制。這使得cas12a在某些難以使用cas9進行編輯的生物體中更具優勢。此外，cas12a的反式切割活性使其在核酸檢測中表現出更高的靈敏度和特異性。目前，crispr/cas12系統已被應用于多種生物的基因組編輯，包括植物、動物和微生物

4、在我國糧食作物中，玉米種植面積及產量均居首位，其中的大部分用于飼料生產。近年來，隨著我國經濟和社會的不斷發展，人民健康理念正在不斷升級，這種飲食結構的變化推動著肉禽蛋奶等消費需求增長，也驅動著農業、畜牧業和食品加工業的快速發展，而玉米是轉化肉禽蛋奶的飼料中的主要原料。因此，不斷提高玉米產量對我國的糧食安全和經濟發展都有重要影響。玉米穗腐病是中國乃至全世界玉米種植區的主要病害之一，由真菌感染形成，在收獲期間發病嚴重的可以導致整個玉米果穗松軟腐爛，致使玉米的產量和品質大幅度下降，同時病原菌分泌的次生代謝物如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynalenol,don)和伏馬毒素(fumonisins,fum)等毒素對人畜健康產生極大危害。不同病原菌引起的癥狀也存在一定程度的差異。由擬輪枝鐮孢菌引起的穗腐病主要特征為籽粒上被覆白色菌絲層；同時擬輪枝鐮孢菌產生的伏馬毒素(fum)對人類和動物危害極大，如人類的食管癌、豬肺水腫和馬腦白質軟化癥等都與該毒素密切相關。由禾谷鐮孢菌引起的穗腐病主要表現為籽粒表面被粉紅色或灰白色菌絲體覆蓋，嚴重時果穗與苞葉粘結在一起；同時禾谷鐮孢菌產生的don對豬的影響比較大，導致豬的食量降低，另外，don也能引起人的頭痛、頭暈等癥狀。玉米穗腐病病原菌主要在玉米種子、病殘體上越冬，為初侵染源。不同的病原菌，其傳播途徑存在一定的差異，擬輪枝鐮孢菌主要通過雨水、花絲和蟲蛀的方式傳播；而禾谷鐮孢菌主要通過花絲和蟲蛀方式進行傳播。另外，病原菌也可以從玉米根部侵入，通過莖稈傳到玉米果穗。玉米穗腐病自幼苗期至成熟收獲期都可能發生,但是，從吐絲到吐絲后的21d內為發病的高峰期。在生產上，玉米穗腐病主要對果穗造成危害，通常從果穗的頂部開始發病，導致發病籽粒灰暗、皺縮、不飽滿、穗軸松軟腐爛，嚴重影響玉米機械化收獲，進而導致產量和品質降低。玉米穗腐病在一般田塊發病率為5％～10％,嚴重的年份可達40％～50％,對于高感品種其發病率可高達50％以上。因此，控制玉米穗腐病的發生和危害具有重要意義。玉米穗腐病常在玉米生育后期發生，田間防治難度大，種植抗病品種是從根源上防治這一病害的關鍵。依靠傳統育種培育出抗病品種，費時費力，浪費了大量資源，將基因編輯技術與玉米種植抗病種植相結合，不僅可以大大縮短育種年限，還可以節約大量資源，已逐步發展成為現代育種新手段。

技術實現思路

1、本發明的目的是提供敲除zm00001d008500基因在提高玉米穗腐病抗性中的應用。

2、第一方面，本發明要求保護抑制zm00001d008500基因編碼蛋白的表達和/或活性在如下任一中的應用：

3、(a1)提高玉米對穗腐病的抗性；

4、(a2)提高玉米對穗腐病病原菌的抗性。

5、其中，抑制zm00001d008500基因編碼蛋白的表達和/或活性可通過如下6種調控水平中至少一種實現：1)在基因轉錄水平上抑制所述zm00001d008500基因的表達；2)在基因轉錄后水平上抑制所述zm00001d008500基因表達(也就是通過對相關基因的初級轉錄物的剪接或加工實現抑制所述zm00001d008500基因編碼蛋白的表達)；3)在對基因的rna轉運水平上抑制所述zm00001d008500基因編碼蛋白的表達(也就是通過對相關基因的mrna由細胞核向細胞質轉運進行調控實現抑制所述zm00001d008500基因編碼蛋白表達)；4)在對基因的翻譯水平上進行調控實現抑制所述zm00001d008500基因編碼蛋白表達；5)在對基因的mrna降解水平上進行調控實現抑制所述zm00001d008500基因編碼蛋白表達；6)在對基因的翻譯后水平上進行調控實現抑制所述zm00001d008500基因編碼蛋白活性。下同。

6、第二方面，本發明要求保護能夠抑制zm00001d008500基因編碼蛋白的表達量和/或活性的物質在如下任一中的應用：

7、(a1)提高玉米對穗腐病的抗性；

8、(a2)提高玉米對穗腐病病原菌的抗性。

9、在前文第一方面和第二方面中，抑制所述zm00001d008500基因編碼蛋白的表達和/或活性可通過如下方式實現：敲除或降低玉米基因組中所述zm00001d008500基因的表達。

10、在前文第二方面中，所述物質可為能夠敲除或降低玉米基因組中所述zm00001d008500基因的表達的物質。

11、進一步地，抑制所述zm00001d008500基因編碼蛋白的表達和/或活性可通過向玉米中導入靶向玉米基因組中所述zm00001d008500基因的crispr/cas(如cas12)編輯工具或sirna或shrna等實現。相應地，所述物質可為靶向玉米基因組中所述zm00001d008500基因的crispr/cas(如cas12)編輯工具或sirna或shrna等。

12、在本發明的一個實施案例中，所述crispr/cas編輯工具的靶序列如seq?id?no.1所示。

13、第三方面，本發明要求保護如下任一方法：

14、方法i：一種提高玉米對穗腐病的抗性的方法，可包括如下步驟：抑制玉米基因組中zm00001d008500基因編碼蛋白的表達量和/或活性，從而實現提高玉米對穗腐病的抗性。

15、方法ii：一種提高玉米對穗腐病病原菌的抗性的方法，可包括如下步驟：抑制玉米基因組中zm00001d008500基因編碼蛋白的表達量和/或活性，從而實現提高玉米對穗腐病病原菌的抗性。

16、方法iii：一種培育對穗腐病的抗性提高的玉米品種的方法，可包括如下步驟：抑制玉米基因組中zm00001d008500基因編碼蛋白的表達量和/或活性，從而實現培育對穗腐病的抗性提高的玉米品種。

17、方法iv：一種培育對穗腐病病原菌的抗性提高的玉米品種的方法，可包括如下步驟：抑制玉米基因組中zm00001d008500基因編碼蛋白的表達量和/或活性，從而實現培育對穗腐病病原菌的抗性提高的玉米品種。

18、進一步地，在所述方法中，抑制玉米基因組中所述zm00001d008500基因編碼蛋白的表達量和/或活性可通過如下方式實現：敲除或降低玉米基因組中所述zm00001d008500基因的表達。

19、更進一步地，在所述方法中，抑制玉米基因組中所述zm00001d008500基因編碼蛋白的表達量和/或活性可通過向玉米中導入靶向玉米基因組中所述zm00001d008500基因的crispr/cas(如cas12)編輯工具或sirna或shrna等實現。

20、在本發明的一個實施案例中，所述crispr/cas編輯工具的靶序列如seq?id?no.1所示。

21、在本發明的一個實施案例中，抑制玉米基因組中所述zm00001d008500基因編碼蛋白的表達量和/或活性具體為將玉米基因組中所述zm00001d008500基因中的seq?idno.3中的第1652位a進行單堿基缺失(從而形成移碼突變)。

22、在上述各相關方面中，所述穗腐病病原菌可為禾谷鐮孢菌(fusariumgraminearum)。本發明的一個實施案例中，所述穗腐病病原菌為禾谷鐮孢菌(fusariumgraminearum)cicc?2697。

23、在上述各相關方面中，所述zm00001d008500基因編碼蛋白可為如下任一：

24、(b1)氨基酸序列為seq?id?no.2的蛋白質；

25、(b2)將seq?id?no.2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的且來源于玉米的蛋白質；

26、(b3)與(b1)-(b2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且來源于玉米的具有相同功能的蛋白質；

27、(b4)在(b1)-(b3)中任一所限定的蛋白質的n端和/或c端連接標簽后得到的融合蛋白。

28、上述蛋白質中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用國際互聯網上的同一性檢索站點測定氨基酸序列的同一性，如ncbi主頁網站的blast網頁。例如，可在高級blast2.1中，通過使用blastp作為程序，將expect值設置為10，將所有filter設置為off，使用blosum62作為matrix，將gap?existence?cost，per?residue?gap?cost和lambda?ratio分別設置為11、1和0.85(缺省值)，并進行檢索一對氨基酸序列的同一性進行計算，然后即可獲得同一性的值(％)。

29、所述80％以上的同一性可為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述85％以上的同一性可為至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述90％以上的同一性可為至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述95％以上的同一性可為至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

30、在上述各相關方面中，所述zm00001d008500基因可為如下任一：

31、(c1)seq?id?no.3所示的dna分子；

32、(c2)在嚴格條件下與(c1)限定的dna分子雜交且編碼所述zm00001d008500基因編碼蛋白的dna分子；

33、(c3)與(c1)-(c2)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且編碼所述zm00001d008500基因編碼蛋白的dna分子。

34、上述基因中，可使用國際互聯網上的同一性檢索站點測定核苷酸序列的同一性，如ncbi主頁網站的blast網頁。例如，可在高級blast2.1中，通過使用blastp作為程序，將expect值設置為10，將所有filter設置為off，使用blosum62作為matrix，將gap?existencecost，per?residue?gap?cost和lambda?ratio分別設置為11、1和0.85(缺省值)，并進行檢索一對核苷酸序列的同一性進行計算，然后即可獲得同一性的值(％)。

35、上述基因中，所述95％以上的同一性可為至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同一性可為至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同一性可為至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同一性可為至少81％、82％、83％、84％的同一性。

36、實驗證明：本發明通過基因編輯手段，敲除玉米基因組中zm00001d008500基因，能夠顯著提高玉米的穗腐病抗性。本發明對于快速創制抗玉米穗腐病種質具有重要意義。