本發(fā)明涉及醫(yī)用敷料，具體為一種重組膠原蛋白敷料的制備方法。
背景技術(shù)：
1、醫(yī)用敷料是用于覆蓋和保護(hù)傷口、創(chuàng)面，促進(jìn)傷口愈合的一類醫(yī)療用品。它可以與傷口直接接觸，材料多樣，包括天然材料、合成材料或兩者的結(jié)合，并且在設(shè)計(jì)和功能上有多種類型，以滿足不同傷口狀況的需求。醫(yī)用敷料的作用在于保護(hù)創(chuàng)面、吸收滲出物、促進(jìn)愈合、減輕疼痛、固定作用等。
2、醫(yī)用敷料能在傷口表面形成物理屏障，防止外界的細(xì)菌、灰塵、液體等污染物進(jìn)入傷口，避免傷口感染。例如，在手術(shù)后的切口處使用合適的敷料，可有效阻擋外部環(huán)境中的病原體，為傷口愈合創(chuàng)造一個(gè)清潔的環(huán)境。傷口在愈合過程中會(huì)產(chǎn)生滲出液，包括血液、組織液等。醫(yī)用敷料可以吸收這些滲出物，保持傷口周圍皮膚的干燥。像一些具有高吸水性的敷料，對(duì)于滲出較多的慢性傷口或大面積創(chuàng)傷，可以有效地管理滲出液，防止皮膚浸漬和傷口周圍組織的炎癥。部分醫(yī)用敷料含有特殊成分，如生長(zhǎng)因子、膠原蛋白等，這些成分可以刺激細(xì)胞增殖、促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)，加速傷口愈合過程。比如含有重組人表皮生長(zhǎng)因子的敷料，對(duì)于燒傷、潰瘍等創(chuàng)面的愈合有積極的促進(jìn)作用。某些敷料具有舒緩和減輕疼痛的特性。它們可以通過保持傷口濕潤(rùn)環(huán)境、減少神經(jīng)末梢的刺激來緩解疼痛。例如，水膠體敷料在與傷口接觸后形成的濕潤(rùn)環(huán)境，能在一定程度上減輕患者的疼痛，尤其是對(duì)于一些擦傷、淺度燒傷等疼痛明顯的傷口。醫(yī)用敷料可以用于固定傷口處的藥物、器械等。比如在骨折固定的小夾板外使用敷料包扎，既能保護(hù)皮膚，又能使夾板保持在合適的位置，保證固定效果，有利于骨折的恢復(fù)，在一些傷口敷藥后，敷料能防止藥物移位，確保藥物持續(xù)發(fā)揮作用。
3、膠原蛋白敷料是一種用于創(chuàng)傷愈合和肌膚修復(fù)的材料。它主要由膠原蛋白構(gòu)成，膠原蛋白是一種結(jié)構(gòu)體，具有良好的延展性、張力和強(qiáng)度。膠原蛋白敷料利用膠原蛋白的特性，貼附在創(chuàng)傷表面或肌膚上，形成一個(gè)保護(hù)層，促進(jìn)組織的再生和修復(fù)。膠原蛋白敷料的工作原理基于膠原蛋白的特性和活性成分。膠原蛋白能夠與創(chuàng)傷表面或肌膚結(jié)合，并吸收水分，促進(jìn)組織的愈合和修復(fù)。膠原蛋白敷料還能持續(xù)釋放膠原蛋白的活性成分，加速創(chuàng)傷愈合和肌膚的恢復(fù)過程。通過保濕、修復(fù)和促進(jìn)再生。醫(yī)用重組膠原蛋白是利用dna重組技術(shù)制備的膠原蛋白，它的氨基酸序列可以按照需求進(jìn)行設(shè)計(jì)，基因序列與人的基因序列高度一致，組織相容性很好。這種膠原蛋白可以被人體直接吸收，參與構(gòu)建膠原，幫助修復(fù)受損組織和填充凹陷部位。利用重組膠原蛋白構(gòu)建醫(yī)用敷料是極具前景的研究方向，然而目前，受到膠原蛋白性能的限制，此類醫(yī)用敷料的療效普遍有待改善。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種重組膠原蛋白敷料的制備方法，以解決常規(guī)醫(yī)用敷料的療效有待改善的技術(shù)問題。
2、為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
3、一種重組膠原蛋白敷料的制備方法，包括：
4、1）以堆疊短序列和人源膠原蛋白短序列為重復(fù)單元，重復(fù)8次構(gòu)成重組膠原蛋白；其中，所述的堆疊短序列由人源膠原蛋白中g(shù)-x-y型三聯(lián)體氨基酸序列構(gòu)成，所述的人源膠原蛋白為i型、iii型、iv型、v型、vii型和xvii型人源膠原蛋白中的任意一種或多種；所述的人源膠原蛋白短序列由iii型人源膠原蛋白α1鏈中連續(xù)的(g-x-y)10的氨基酸序列構(gòu)成；其中，g為甘氨酸殘基，x或y代表任意一種氨基酸殘基；
5、2）分別取高、低分子量的透明質(zhì)酸混合后加pbs溶解得到ha溶液，取羧甲基殼聚糖加pbs完全溶解得到cmcs溶液，取4-甲醛基苯硼酸加無水乙醇完全溶解得到4-fpba溶液；將ha溶液、4-fpba溶液、cmcs溶液依次按先后順序，混合攪拌而成cfhh水凝膠，冷凍干燥后得到水凝膠凍干粉末；
6、3）取卡波姆、尼泊金丙酯鈉以及步驟1）得到的重組膠原蛋白，分別用純化水浸泡至溶解；將溶解的料體加入到攪拌容器中，再向其中加入薄荷腦、乙二胺四乙酸二鈉以及步驟2）得到的水凝膠凍干粉末，攪拌；而后加入三乙醇胺將料體攪拌至凝膠狀，得到所述重組膠原蛋白敷料。
7、作為優(yōu)選，步驟1）中，采用ppic9k表達(dá)載體和畢赤酵母，構(gòu)建出重組畢赤酵母基因工程菌；基因工程菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，重組人源膠原蛋白分泌到發(fā)酵液；收集的發(fā)酵液，采用層析分離純化手段，經(jīng)冷凍干燥后，得到重組膠原蛋白。
8、作為優(yōu)選，步驟1）中，對(duì)于冷凍干燥得到的重組膠原蛋白，用截?cái)喾肿恿繛?0kda的超濾柱膜分離上清液，去除小分子量蛋白和鹽，再經(jīng)過分子篩層析純化重組膠原蛋白，使用純水為流動(dòng)相，流速0.5ml/min進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰中的樣品，并冷凍干燥，得到成品。
9、作為優(yōu)選，步驟2）中，低分子量的透明質(zhì)酸的分子量范圍為2000~5000。
10、作為優(yōu)選，步驟2）中，高分子量的透明質(zhì)酸的分子量范圍為10萬~150萬。
11、作為優(yōu)選，步驟2）中，cmcs溶液的濃度為5wt%；4-fpba溶液的濃度為3wt%；ha溶液的濃度為8wt%，其中高低分子量ha濃度均為4wt%；混合時(shí)ha溶液、4-fpba溶液、cmcs溶液的溶液體積比2:0.5:2。
12、作為優(yōu)選，步驟2）中，所述混合攪拌的轉(zhuǎn)速為300~500rpm，所述混合攪拌的溫度為45~55℃，在所述混合攪拌的過程中，體系持續(xù)處于超聲震蕩環(huán)境中。
13、作為優(yōu)選，步驟3）中，卡波姆、尼泊金丙酯鈉、重組膠原蛋白、薄荷腦、乙二胺四乙酸二鈉、水凝膠凍干粉末、三乙醇胺的質(zhì)量比為25~30:8~11:15~17:2~4:6~10:10~12:2~3。
14、作為優(yōu)選，步驟3）中，所述純化水浸泡的溫度為50~60℃，浸泡時(shí)長(zhǎng)不少于1h。
15、作為優(yōu)選，步驟3）中第一段攪拌的時(shí)長(zhǎng)為2~3h，第二段攪拌的時(shí)長(zhǎng)為30~60min。
16、本發(fā)明提供了一種重組膠原蛋白敷料的制備方法。該技術(shù)方案通過由堆疊短序列與連續(xù)的人源膠原蛋白氨基酸短序列重復(fù)多次進(jìn)行組合，形成具有特異性的重組膠原蛋白，確保其與人源膠原蛋白的高度相似性。在此基礎(chǔ)上，通過以4-fpba作為交聯(lián)劑，分別與cmcs和兩種不同大小分子量的ha形成對(duì)ph有響應(yīng)的席夫堿鍵和對(duì)葡萄糖有響應(yīng)的硼酸酯鍵，進(jìn)而合成了雙動(dòng)態(tài)共價(jià)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)黏附性水凝膠。基于以上構(gòu)建的重組膠原蛋白和水凝膠，本發(fā)明制備得到醫(yī)用敷料，重組膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合，通過細(xì)胞骨架誘發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)來調(diào)控細(xì)胞行為，能夠有效改善皮膚微循環(huán)，修護(hù)肌膚的屏障；水凝膠敷料基質(zhì)具有抗炎、抗氧化、抗菌、促進(jìn)愈合等作用，顯著提升了敷料的生物學(xué)性能，有助于促進(jìn)創(chuàng)面愈合，具有更好的療效。
1.一種重組膠原蛋白敷料的制備方法，其特征在于，包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組膠原蛋白敷料的制備方法，其特征在于，步驟1）中，采用ppic9k表達(dá)載體和畢赤酵母，構(gòu)建出重組畢赤酵母基因工程菌；基因工程菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，重組人源膠原蛋白分泌到發(fā)酵液；收集的發(fā)酵液，采用層析分離純化手段，經(jīng)冷凍干燥后，得到重組膠原蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組膠原蛋白敷料的制備方法，其特征在于，步驟1）中，對(duì)于冷凍干燥得到的重組膠原蛋白，用截?cái)喾肿恿繛?0kda的超濾柱膜分離上清液，去除小分子量蛋白和鹽，再經(jīng)過分子篩層析純化重組膠原蛋白，使用純水為流動(dòng)相，流速0.5ml/min進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰中的樣品，并冷凍干燥，得到成品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組膠原蛋白敷料的制備方法，其特征在于，步驟2）中，低分子量的透明質(zhì)酸的分子量范圍為2000~5000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組膠原蛋白敷料的制備方法，其特征在于，步驟2）中，高分子量的透明質(zhì)酸的分子量范圍為10萬~150萬。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組膠原蛋白敷料的制備方法，其特征在于，步驟2）中，cmcs溶液的濃度為5wt%；4-fpba溶液的濃度為3wt%；ha溶液的濃度為8wt%，其中高低分子量ha濃度均為4wt%；混合時(shí)ha溶液、4-fpba溶液、cmcs溶液的溶液體積比2:0.5:2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組膠原蛋白敷料的制備方法，其特征在于，步驟2）中，所述混合攪拌的轉(zhuǎn)速為300~500rpm，所述混合攪拌的溫度為45~55℃，在所述混合攪拌的過程中，體系持續(xù)處于超聲震蕩環(huán)境中。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組膠原蛋白敷料的制備方法，其特征在于，步驟3）中，卡波姆、尼泊金丙酯鈉、重組膠原蛋白、薄荷腦、乙二胺四乙酸二鈉、水凝膠凍干粉末、三乙醇胺的質(zhì)量比為25~30:8~11:15~17:2~4:6~10:10~12:2~3。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組膠原蛋白敷料的制備方法，其特征在于，步驟3）中，所述純化水浸泡的溫度為50~60℃，浸泡時(shí)長(zhǎng)不少于1h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組膠原蛋白敷料的制備方法，其特征在于，步驟3）中第一段攪拌的時(shí)長(zhǎng)為2~3h，第二段攪拌的時(shí)長(zhǎng)為30~60min。