本公開屬于生物醫藥領域，具體涉及靶向調控lpa基因表達的sirna雙鏈體及其在預防和治療心腦血管相關疾病中的用途。

背景技術：

1、核酸藥物尤其是寡核苷酸藥物，由于其合成簡單、活性較高而得到廣泛應用。寡核苷酸藥物通常包括反義寡核苷酸（aso）、小干擾rna（sirna）、微小rna（mirna）和核酸適配體等。

2、寡核苷酸是一類短的dna或rna分子、寡聚體，寡核苷酸能夠以序列特異性的方式與各自的互補寡核苷酸、dna或rna結合，形成雙鏈體，或者，盡管較不常見，但有些情況下形成更高階的雜合體。寡核苷酸能夠序列特異性地與互補的rna鏈結合，雜交后能夠誘導rnase?h裂解靶rna。天然的寡核苷酸中，核苷酸之間由磷酸二酯鍵連接，在生理條件下，寡核苷酸對核酸酶特別敏感，因此在制備寡核苷酸藥物時，天然的、未經改造的或未經修飾的寡核苷酸在體內容易被快速降解，因此能夠發揮的活性非常有限，因而成藥性差。對寡核苷酸進行修飾是提高其活性的有效方式，可以提高其對核酸酶的穩定性、與rna的親和性，并能更好地促進細胞內吞和組織靶向，從而有效調控靶基因的表達。

3、核苷酸的基本結構通常可劃分為堿基、核糖、磷酸骨架和末端四個部分，這四個部分的修飾可以舉例如下：

4、1）堿基的修飾：主要分為嘌呤修飾、嘧啶修飾以及堿基替換三種形式。嘌呤修飾包括n6-甲基腺苷、n1-甲基腺苷、7-甲基鳥苷酸修飾；嘧啶修飾包括3-甲基尿嘧啶核苷、5-甲基尿嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶核苷、n4?-乙酰胞苷、假尿苷、硫尿核苷、丙炔尿嘧啶核苷以及二氫尿嘧啶核苷等修飾。

5、2）核糖的修飾：主要分為核糖環特定位置處的基團的修飾和替換等。核糖的修飾包括但不限于2’-位修飾、4’-位修飾、5’-位修飾、異構修飾等。核糖2’-位修飾中最為常見的是2’-ome（2’-甲氧基）修飾及2’-f（2’-氟代）修飾。相比天然的寡核苷酸，同時采用2’-ome及2’-f修飾后的寡核苷酸具有更高的tm值、更強的血清穩定性和更好的活性。

6、3）磷酸骨架的修飾：主要的修飾方式包括但不限于硫代磷酸酯的修飾；經甲基磷酸酯、硒代磷酸酯、甲硼基磷酸酯、雙硫代磷酸酯，以及用硫原子取代磷酸二酯鍵連接區的橋氧原子修飾；將核苷之間的磷酸酯基整個替換為不含磷原子的基團，如將p原子替換為c原子、s原子以及n原子等，從而形成胍基、s-甲基硫脲或硝酸酯等。

7、4）末端修飾：包括但不限于在正義鏈的5’末端和/或3’末端以共價鍵連接特定基團、反義鏈5’末端磷酸化修飾等。

8、脂蛋白(a)(lipoprotein(a)，lp(a))是利用免疫方法發現的一種特殊類型的脂蛋白顆粒，其在心血管疾病發生發展過程中發揮作用，是心血管疾病的重要危險因素。lp(a)由包含膽固醇、氧化磷脂（oxpl）等脂質成分的ldl樣(ldl-like)顆粒與載脂蛋白a?(apo(a))以及載體蛋白b-100等組成，其中載脂蛋白b-100通過共價鍵與apo(a)結合。apo(a)是一種高度多態性的糖蛋白，其由lpa基因編碼。

9、目前認為lp(a)通過多種方式促進動脈粥樣硬化斑塊的形成。流行病學和遺傳學研究表明，lp(a)水平升高是引發心血管疾病的獨立危險因素，即使ldl-c水平被控制在當前指南規定的最佳范圍內，與lp(a)相關的心血管風險仍然存在。因此，抑制lpa基因的表達水平，能夠降低動脈粥樣硬化及其相關心血管事件的發生風險。能夠用于患有脂蛋白(a)相關疾病的患者的替代療法和組合療法是臨床上需要的。

技術實現思路

1、為了解決現有技術中缺乏一種更為有效的靶向調控lpa基因表達的sirna雙鏈體的技術問題，本公開提供了靶向調控lpa基因表達的sirna雙鏈體及其在預防和治療心腦血管相關疾病中的用途。本公開通過對sirna基礎序列進行修飾，篩選出了多個對lpa基因表達具有顯著抑制作用的sirna修飾物，并且提供了相應的sirna綴合物。

2、本公開的技術方案包括但不限于：

3、一方面，本公開提供了一種sirna雙鏈體，其包含由正義鏈和反義鏈配對組成的寡核苷酸雙鏈體。

4、另一方面，本公開提供了一種用于降低lpa的表達的綴合物，其包括上述sirna雙鏈體，及與其連接的綴合基團。

5、另一方面，本公開提供了一種核酸蛋白復合物，其包含上述sirna雙鏈體的雙鏈區或雙鏈區的反義鏈，以及核酸酶。

6、另一方面，本公開提供了一種重組載體，包含編碼上述sirna雙鏈體的核酸分子。

7、一些實施方案中，所述重組載體的載體骨架選自重組類病毒衍生的環狀rna載體、trna、rrna支架和嵌合trna/pre-mi?rna載體。

8、另一方面，本公開提供了一種重組細胞，其合成并分泌上述sirna雙鏈體。

9、一些實施方案中，所述重組細胞選自嗜硫紅假單胞菌和核糖核酸酶iii缺陷的谷氨酸棒狀桿菌。

10、另一方面，本公開提供了一種制備sirna雙鏈體的方法，包括培養上述重組細胞，或化學合成。

11、另一方面，本公開提供了一種藥物組合物，其包括上述sirna雙鏈體、上述綴合物，或者上述核酸蛋白復合物，以及藥學上可接受的載體。

12、另一方面，本公開提供了一種抑制lpa基因表達的方法，包括將上述sirna雙鏈體、上述綴合物、上述核酸蛋白復合物、或上述藥物組合物與靶細胞接觸。

13、一些實施方案中，所述方法為非診斷或非治療目的的。

14、一些實施方案中，所述方法為體內的或體外的。

15、另一方面，本公開提供了一種上述sirna雙鏈體、上述綴合物、上述核酸蛋白復合物、或上述藥物組合物在制備治療與lpa基因表達相關疾病的藥物中的應用。

16、所述lpa基因表達相關疾病選自apo(a)蛋白過表達、lpa基因致病突變、apo(a)蛋白代謝異常、lpa或apo(a)與另一物質的異常相互作用導致的疾病。

17、一些實施方案中，所述lpa基因表達相關疾病選自伯格氏病(berger’s?disease)、外周動脈疾病、冠狀動脈疾病、代謝綜合征、急性冠脈綜合征、主動脈瓣狹窄、主動脈瓣反流、主動脈夾層、視網膜動脈阻塞、腦血管疾病、腸系膜缺血、腸系膜上動脈阻塞、腎動脈狹窄、穩定型/不穩定型心絞痛、急性冠脈綜合征、雜合子或純合子家族性高膽固醇血癥、高載脂蛋白β脂蛋白血癥、腦血管動脈粥樣硬化、腦血管疾病和靜脈血栓形成、中風、動脈粥樣硬化、血栓形成、冠心病或主動脈瓣狹窄和/或與lp(a)顆粒的水平升高相關的任何其他疾病以及其他尚未鑒定的相關病癥、病理或綜合征。

18、另一方面，本公開提供了一種上述sirna雙鏈體、上述綴合物、上述核酸蛋白復合物、或上述藥物組合物用于治療與lpa基因表達相關疾病。

19、另一方面，本公開提供了一種用于治療與lpa基因表達相關疾病的方法，包括向有需要的受試者施用有效量的上述sirna雙鏈體、上述綴合物、上述核酸蛋白復合物、或上述藥物組合物。

20、另一方面，本公開提供了一種上述sirna雙鏈體、上述綴合物、上述核酸蛋白復合物、或上述藥物組合物在制備預防或治療動脈粥樣硬化和心腦血管疾病藥物中的應用。

21、另一方面，本公開提供了一種上述sirna雙鏈體、上述綴合物、上述核酸蛋白復合物、或上述藥物組合物用于預防或治療動脈粥樣硬化和心腦血管疾病。

22、另一方面，本公開提供了一種用于預防或治療動脈粥樣硬化和心腦血管疾病的方法，包括向有需要的受試者施用有效量的上述sirna雙鏈體、上述綴合物、上述核酸蛋白復合物、或上述藥物組合物。

23、本公開所取得的有益效果至少如下：

24、（1）sirna基礎序列，例如sirna?b01001、b01023、b01042、b01047、b02417、b06001、b01801、b01012，對lpa基因均具有顯著抑制作用，抑制率最高可超過50%。

25、（2）本公開的sirna修飾物對于lpa基因的抑制率最高可達70%以上。并且，修飾物與galnac綴合基團連接后形成相應的sirna綴合物，可以高效遞送至動物肝臟，并顯著抑制lpa基因，顯著降低血清lp(a)蛋白水平。

26、（3）本公開采用交替修飾和本公開修飾模板修飾的各序列，同現有技術公開的序列差異很小的sirna相比，對lpa抑制活性均顯著提升，最多可提高36.0%。