本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種用于空間crispr篩選測序的直接捕獲sgrna探針及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、生物系統(tǒng)在本質(zhì)上呈現(xiàn)出顯著的空間有序性特征，細(xì)胞間的相互作用以及分子層面的各類過程均在特定的空間環(huán)境中展開。在空間生物學(xué)領(lǐng)域的眾多先進(jìn)研究手段里，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)已充分展現(xiàn)出其強(qiáng)大的研究能力。它不僅能夠深入探究組織結(jié)構(gòu)、空間維度下的基因表達(dá)模式，還可以對細(xì)胞群體以及細(xì)胞間的相互作用進(jìn)行細(xì)致研究。然而，目前能夠在基因表達(dá)與空間表型的功能影響之間搭建起因果關(guān)聯(lián)的工具仍處于匱乏狀態(tài)，同時，驅(qū)動這些生物學(xué)過程的調(diào)控通路也遠(yuǎn)未得到充分挖掘。

2、crispr-cas9技術(shù)通過sgrna介導(dǎo)cas9蛋白實現(xiàn)精準(zhǔn)的基因組編輯，為功能基因組學(xué)研究帶來了革命性突破。該技術(shù)能夠?qū)⒒驍_動與特定表型（如細(xì)胞生長、存活率、標(biāo)志基因表達(dá)等）直接關(guān)聯(lián)，極大地推進(jìn)了基因功能研究。隨著crispr篩選技術(shù)向高通量水平發(fā)展，研究人員得以系統(tǒng)性地探究基因功能。此外，單細(xì)胞rna測序（single-cell?rna-seq）技術(shù)的出現(xiàn)，使得在單細(xì)胞擾動條件下進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)分析成為可能。其中，perturb-seq作為crispr介導(dǎo)的典型平臺，雖然在單細(xì)胞水平實現(xiàn)了基因擾動與轉(zhuǎn)錄組分析的整合，但其應(yīng)用常受限于特定的質(zhì)粒系統(tǒng)設(shè)計，需要在mrna中攜帶與sgrna對應(yīng)的序列。10×genomics公司開發(fā)的直接捕獲sgrna的perturb-seq技術(shù)突破了這一限制，可兼容幾乎所有類型的sgrna表達(dá)質(zhì)粒，推動了單細(xì)胞perturb-seq技術(shù)的廣泛應(yīng)用，但在空間轉(zhuǎn)錄層面的應(yīng)用仍存在明顯局限性。

3、當(dāng)前，以單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組為讀取輸出的高通量空間crispr篩選測序方法尚屬空白，在空間層面直接捕獲sgrna的方法也同樣缺失，這為空間生物學(xué)的進(jìn)一步研究帶來挑戰(zhàn)的同時也為其創(chuàng)新發(fā)展提供了機(jī)遇。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、技術(shù)問題

2、本發(fā)明旨在開發(fā)一種超高重的靶向捕獲探針，通過結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，應(yīng)用于空間crispr篩選測序。

3、技術(shù)方案

4、本發(fā)明第一方面提供了用于空間crispr篩選測序的直接捕獲sgrna探針，所述直接捕獲sgrna探針基于目標(biāo)物種特定基因的sgrna序列設(shè)計；其中，所述直接捕獲sgrna探針包括左側(cè)探針和右側(cè)探針；所述sgrna包含支架序列和原間隔序列；其中，所述左側(cè)探針由核酸序列1和核酸序列2組成；所述右側(cè)探針由核酸序列3、核酸序列4及poly-a尾組成；其中，所述核酸序列1為二代測序所需的read2序列；所述核酸序列2與sgrna的支架序列5’端的6-30?bp序列反向互補(bǔ)；所述核酸序列3與sgrna的支架序列5’端的起始5?bp序列反向互補(bǔ)；所述核酸序列4與sgrna的原間隔序列反向互補(bǔ)。

5、在一些實施例中，所述左側(cè)探針和右側(cè)探針為dna；所述左側(cè)探針長度為46?bp，所述右側(cè)探針長度為55?bp；其中，所述核酸序列1長度為21?bp，所述核酸序列2長度為25?bp，所述核酸序列3長度為5?bp，所述核酸序列4長度為20~30?bp，所述poly-a尾的長度為至少20?bp。

6、在一些實施例中，當(dāng)所述目標(biāo)物種為小鼠時，所述右側(cè)探針中的核酸序列4長度為20?bp。

7、在一些實施例中，所述左側(cè)序列如seq?id?no.1所示，右側(cè)序列如seq?id?no.2~seq?id?no.121所示。

8、在一些實施例中，左側(cè)探針和右側(cè)探針在空間crispr篩選測序過程中通過t4連接酶的作用下進(jìn)行夾板連接。

9、本發(fā)明第二方面提供了一種空間crispr篩選測序方法，包括如下步驟：s1：將含有crispr敲除文庫的目標(biāo)細(xì)胞注入實驗動物體內(nèi)；s2：取出目標(biāo)細(xì)胞浸潤后的組織，制備石蠟切片，并進(jìn)行he染色及成像；s3：成像后的組織切片經(jīng)歷透化、解交聯(lián)后，與全轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)探針以及上述任意一項所述的直接捕獲sgrna探針進(jìn)行探針雜交；雜交后的直接捕獲sgrna探針的左側(cè)探針和右側(cè)探針在t4連接酶的作用下進(jìn)行夾板連接；s4：利用visium?hd進(jìn)行空間mrna文庫構(gòu)建和空間sgrna文庫構(gòu)建；s5：分別對空間mrna文庫和空間sgrna文庫進(jìn)行測序和基因序列比對，得到攜帶空間坐標(biāo)的普通轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)和crispr?sgrna文庫測序數(shù)據(jù)。

10、在一些實施例中，所述含有crispr敲除文庫的目標(biāo)細(xì)胞通過以下步驟獲得：制備crispr篩選文庫病毒，使受試細(xì)胞感染crispr篩選文庫病毒，分選出陽性感染的受試細(xì)胞并培養(yǎng)一段時間，獲得含有crispr敲除文庫的目標(biāo)細(xì)胞。

11、在一些實施例中，所述注入實驗動物體內(nèi)的方式為靜脈注入、皮下注入、肌肉注入或腫瘤注入。

12、在一些實施例中，所述組織為腫瘤組織或正常組織。

13、在一些實施例中，還包括將所述普通轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)和crispr?sgrna文庫測序數(shù)據(jù)根據(jù)相同的空間坐標(biāo)，合并為同一張芯片的數(shù)據(jù)。

14、本發(fā)明第三方面提供了上述任意一項所述的直接捕獲sgrna探針在空間crispr篩選測序中的應(yīng)用。

15、本發(fā)明第四方面提供了上述任意一項所述的空間crispr篩選測序方法在驗證基因功能中的應(yīng)用。

16、本發(fā)明第五方面提供了上述任意一項所述的空間crispr篩選測序方法在探究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制中的應(yīng)用。

17、在一些實施例中，對所述普通轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行無偏聚類，對聚類后的每一類與其他所有類做差異分析，得到每一類的標(biāo)志性基因，作為每一類的關(guān)鍵特征；根據(jù)crisprsgrna文庫測序數(shù)據(jù)，對sgrna在不同聚類中的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，得到sgrna敲除基因的目標(biāo)細(xì)胞傾向于富集的聚類，從而驗證sgrna靶標(biāo)基因的功能。

18、技術(shù)效果

19、本發(fā)明通過超高重的靶向捕獲探針，結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)開發(fā)的空間crispr篩選測序（spac-seq）技術(shù)是一種通用的空間crispr篩選技術(shù)，可兼容多種高通量、基于單細(xì)胞測序的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)平臺，包括10×genomics?visium?hd。

20、本發(fā)明提供的直接捕獲sgrna探針具有高度的特異性，具體地，兩個探針中，一個與sgrna的20?bp?protospacer進(jìn)行互補(bǔ)配對，但存在同樣與該sgrna的靶基因?qū)?yīng)的mrna互補(bǔ)配對，為了避免這種錯配，一方面，該sgrna特異性的探針仍有5?bp與sgrna的scaffold配對，并且更重要的，另一條互補(bǔ)后則完全相鄰的探針（帶有21?bp建庫必需序列并有25?bp互補(bǔ)配對在scaffold），可以在t4連接酶的催化下，與這條sgrna特異性的探針進(jìn)行連接。連接成功后的探針，一方面具備了來自兩端的兩種探針各自互補(bǔ)配對的特異性，更重要的是，t4夾板連接保證了只有與按照參考序列設(shè)計出的一致的、兩條探針完全相鄰而非間隔的探針才可以連接。這兩方面的特異性使得所得到的探針產(chǎn)物一方面能識別sgrna的protospacer特異性序列，另一方面能識別sgrna而非靶基因的scaffold序列，另一方面是識別特異性序列和sgrna?scaffold序列的兩條探針在空間距離上必須完全符合預(yù)期，這三個特異性一起保證了探針的高度特異性。

21、許多單細(xì)胞crispr篩選和空間crispr篩選方法受限于特定的質(zhì)粒設(shè)計。本發(fā)明提供的直接捕獲型spac-seq（direct?capture?spac-seq）克服了這一限制，就像直接捕獲型perturb-seq（direct?capture?perturb-seq）在單細(xì)胞crispr篩選領(lǐng)域的突破一樣。這一優(yōu)勢使spac-seq能夠應(yīng)用于未來的空間研究，例如crispri/a、orf（開放閱讀框）篩選或其他空間條形碼篩選（spatial?barcoding?screens）。

22、本發(fā)明提供的直接捕獲型spac-seq是一種基于空間層面的單細(xì)胞crispr篩選測序方法，以空間全轉(zhuǎn)錄組作為所研究的生物學(xué)讀出信號，適用于研究基因功能，例如腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制，具體地，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了icam1（胞間黏附分子1）是腫瘤播散后免疫監(jiān)視的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。