本發明涉及生物醫學工程領域，尤其涉及一種微生物-腸-關節軸多器官芯片及其制備方法。

背景技術：

1、骨關節炎(oa)是最常見的關節炎類型之一，是一種慢性退行性和致殘性疾病，會導致重大的健康、經濟和社會問題，但迄今為止的研究工作尚未能夠確定其確切的病因。oa相應的治療策略相對有限，且大部分為對癥治療，包括中度運動和康復策略、藥物干預、晚期oa的關節置換手術。目前尚沒有治療方法能夠令人滿意地停止或延遲骨關節炎的進展或提供有效和持久的癥狀緩解。

2、腸道微生物群(gm)作為一個關鍵的環境因子廣泛參與骨關節的生長發育和炎癥病變的多種生理過程。腸道微生物和關節之間的關系被稱為“微生物-腸-關節軸”，它包含了腸道微生物和關節之間相互作用的復雜路徑和機制。研究微生物-腸-關節軸有助于發現治療關節炎的潛在靶點，有望通過調節腸道菌群改善關節系統疾病。

3、目前，腸道微生物對關節炎影響的機制尚不清楚，主要原因是缺乏有效的體外模型。應用廣泛的動物模型存在明顯的限制和缺陷，除了實驗倫理以及天然存在的基因屏障外，動物和人類的腸道微生物群的組成也存在很大差異。簡單模式動物腸道微生物大多是需氧的，而在人類腸道中專性厭氧細菌占主導地位，動物模型的腸道微生物在數量、種類和復雜程度上都無法概括人類腸道微生物的特性；其次，動物和人類的關節在結構、成分、功能、反應、受力等方面都存在著很大差異，使得動物模型的實驗結果很難向人類患者轉化。此外，臨床研究中受試者的年齡、性別、生理狀況、疾病程度、腸道微生物組成、飲食和補充劑等方面也存在巨大差異。并且臨床樣的本異質性大且研究時間跨度普遍較長。而人類患者的關節研究只能依靠有限的手段進行，活檢樣本數量有限且難以進行后續研究。因此，在體外構建有效的微生物-腸-關節軸模型是研究腸道微生物群對關節發育、退化、炎癥等方面影響的關鍵。

技術實現思路

1、本發明的目的是為了解決現有技術中存在的缺陷，而提出的一種微生物-腸-關節軸多器官芯片及其制備方法。

2、為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：

3、一種微生物-腸-關節軸多器官芯片制備方法，該制備方法具體步驟如下：

4、ⅰ、利用高精度3d打印技術分別制備多器官芯片的上層芯片陽模、中間層芯片陽模和下層芯片陽模；

5、ⅱ、通過光刻加工具有圓柱形微陣列的硅晶片制備多孔膜；

6、ⅲ、制備上層芯片、中間層芯片和下層芯片；

7、ⅳ、組裝制備好的各組芯片。

8、作為本發明的進一步方案，步驟ⅰ所述上層芯片陽模、中間層芯片陽模和下層芯片陽模分別以autocad文件為標準，用solidwork生成3d文件；

9、其中，上層芯片的厚度為2mm，中間層芯片厚度為0.2mm，下層芯片厚度為8mm；

10、所述上層芯片包括微生物-腸共生模塊ⅰ；所述中間層芯片包括血管微通道模塊ⅱ以及滑膜類器官模塊ⅲ；所述下層芯片包括軟骨類器官模塊ⅳ。

11、作為本發明的進一步方案，步驟ⅲ所述制備上層芯片、中間層芯片和下層芯片的具體步驟如下：

12、s1.1：將pdms預聚物分別澆注在上層芯片陽模、中間層芯片陽模和下層芯片陽模內；

13、s1.2：澆注完成后，在-80kpa下脫氣至除去所有氣泡；

14、s1.3：除氣泡完成后，分別將上層芯片和中間層芯片在60℃的條件下固化6h以上，下層芯片在60℃的條件下固化10h以上。

15、作為本發明的進一步方案，步驟ⅳ所述組裝制備好的各組芯片的具體步驟如下：

16、s2.1：將上層芯片進行脫模，再對上層芯片所列打孔位置用punch打孔，再將上層芯片的下表面，即結構開口面，與多孔膜一起進行plasma處理后，將多孔膜與微生物-腸共生模塊ⅰ的彎曲通道部分進行不可逆鍵合；

17、s2.2：將鍵合了多孔膜的上層芯片的下表面和已經固化但未脫模的中間層芯片一起進行plasma處理后，將兩個表面對齊并進行鍵合，鍵合時微生物-腸共生模塊ⅰ和血管微通道模塊ⅱ的彎曲通道部分重疊，并由多孔膜分隔，當鍵合完成后，將中間層從陽模中脫模；

18、s2.3：對上層和中間層芯片鍵合體上所列打孔位置用punch打孔，其打孔位置對應下層芯片上的出入口位置，將鍵合的上層芯片和中間層芯片的下表面，與下層芯片的上表面結構開口面一起進行plasma處理后，將兩個表面對齊并進行鍵合即可得到微生物-腸-關節軸多器官芯片，此時中間層的滑膜類器官模塊ⅲ與下層的軟骨類器官模塊ⅳ相重疊，滑膜類器官模塊ⅲ的圓形結構與軟骨類器官模塊ⅳ的圓形結構為同心圓。

19、作為本發明的進一步方案，s2.1所述上層芯片所列打孔位置包括：微生物-腸共生模塊ⅰ的進口①和出口②對應于上層芯片的開孔位置；微生物-腸共生模塊ⅰ兩側真空腔室的通氣口③和④對應于上層芯片的開孔位置；所述中間層芯片的血管微通道模塊ⅱ的進口⑤和出口⑥對應于上層芯片的開孔位置；所述中間層芯片的滑膜類器官模塊ⅲ的進口⑦、⑨、和出口⑧、⑩、對應于上層芯片的開孔位置；

20、s2.3所述上層和中間層芯片鍵合體上所列打孔位置包括下層芯片的軟骨類器官模塊ⅳ的進口和出口位于中間層芯片的開孔位置。

21、一種微生物-腸-關節軸多器官芯片，包括上層芯片、多孔膜、中間層芯片和下層芯片；

22、所述上層芯片包括微生物-腸共生模塊ⅰ，且上層芯片厚度為2mm；

23、所述多孔膜寬6mm，長10mm，厚度為30μm，孔直徑為8μm，圓孔中心間距為30μm；

24、所述中間層芯片包括血管微通道模塊ⅱ以及滑膜類器官模塊ⅲ，且中間層芯片厚度為200μm，所述滑膜類器官模塊ⅲ的結構厚度為200μm；

25、所述下層芯片包括軟骨類器官模塊ⅳ，且下層芯片的厚度為8mm。

26、作為本發明的進一步方案，所述微生物-腸共生模塊ⅰ和所述血管微通道模塊ⅱ的彎曲通道部分結構上重疊，并通過所述多孔膜進行分隔；

27、所述滑膜類器官模塊ⅲ和軟骨類器官模塊ⅳ在結構上重疊，且兩者的圓形結構為同心圓，所述滑膜類器官模塊ⅲ的圓型結構的直徑r1大于軟骨類器官模塊ⅳ的圓型結構的直徑r2。

28、作為本發明的進一步方案，所述微生物-腸共生模塊ⅰ包括曲線形的上層微通道a和兩個分別位于上層微通道a兩側的曲線形上層真空腔室b和c；

29、所述上層微通道a兩端分別連接有上層微通道的進口①和出口②，兩個所述上層真空腔室b和c分別連接有連接口③和④；

30、所述上層微通道a寬為750μm、厚為500μm；所述上層真空腔室b和c的寬為750μm、厚為500μm。

31、作為本發明的進一步方案，所述血管微通道模塊ⅱ包括曲線形的中間層曲線形微通道d，分別連接有進口⑤和出口⑥，所述中間層曲線形微通道d寬為750μm、厚為200μm；

32、所述滑膜類器官模塊ⅲ包括e-1，e-2，e-3和e-4共4條陣列結構，其中，e-1和e-4有4個結構單元，e-2和e-3有5個結構單元；

33、所述e-1兩端包含進口⑦和出口⑧；所述e-2兩端包含進口⑨和出口⑩；所述e-3兩端包含進口和出口e-4兩端包含進口和出口

34、所述單個結構單元的內直徑r1為5mm，外直徑r3為7mm，單個結構單元從內圓到外圓之間有2組梯形陣列g-1和g-2；

35、所述梯形陣列g-1和g-2分別包含2列間錯的梯形，梯形陣列g-1和g-2之間形成通道結構h-1，梯形陣列g-2和外圓之間形成通道結構h-2，通道結構h-1和通道結構h-2的寬度均為300μm；

36、所述梯形陣列g-1和g-2的梯形，其短邊長度d1為50μm，長邊長度d2為100μm，高度h1為100μm，短邊之間的間距d3為30μm，內圓一側長邊之間的距離d4為50μm，外圓一側長邊之間的距離d5為60μm；

37、所述滑膜類器官模塊ⅲ的兩端分別連接進口和出口

38、作為本發明的進一步方案，所述軟骨類器官模塊ⅳ包含18個球形底的圓錐形培養單元i以及連接培養單元的通道j；

39、所述通道j包含進口和出口

40、所述圓錐形培養單元i的圓錐形深度h2為6mm，最大直徑r2為48mm，球形底部的球形直徑為3mm。

41、相比于現有技術，本發明的有益效果在于：

42、本發明由上層芯片、多孔膜結構、中間層芯片和下層芯片組成，用于微生物-腸-關節軸的體外建模和生理病理研究，該微生物-腸-關節軸多器官芯片可以用人源細胞或類器官進行實驗，實驗結果與人類具有良好的相關性，不存在動物實驗與人類之間的種屬間的差異；同時該微生物-腸-關節軸多器官芯片采用微流控芯片技術，在微通道和腔室內連續不斷灌注流體對細胞和組織進行培養，能夠明顯加快實驗進程，縮短實驗時間；另外本發明的微生物-腸-關節軸多器官芯片結合微流控技術和流體力學采用pdms加工的多器官芯片代替動物實驗，可以極大節約實驗成本，并且不存在實驗倫理的爭議，使其可以擴展至規模化標準化加工生產，以便進行高通量、大規模的實驗研究。