本發明屬于生物化工、合成生物學和基因工程及代謝工程領域，具體涉及一種透明質酸重組菌的構建及其應用。

背景技術：

1、透明質酸(hyaluronic?acid，簡稱ha)，是一種直鏈高分子多糖，由單體n-乙酰氨基葡萄糖和d-葡萄糖醛酸連接而成，分子量能夠達到104～107da，廣泛應用于化妝品、食品、醫藥等領域。ha的生物活性和使用效果由其相對分子量(mw)直接決定，不同分子量的透明質酸具有不同的用途，分子量介于104～106da的低分子量透明質酸主要添加于護膚品和化妝品中，能夠起到良好的保濕功效，還能夠增加皮膚彈性、減少皺紋；分子量低于104da的透明質酸低聚寡糖可以添加于口服保健品中，能夠起到增加細胞新陳代謝、預防衰老的作用。

2、生物發酵法已經成為我國透明質酸生產的主要工藝，工業生產中的常用菌株為獸疫鏈球菌等動物性致病菌，產量為6-12g/l。利用獸疫鏈球菌生產透明質酸也具有一定的局限性：首先，獸疫鏈球菌是動物致病菌，具有致病性風險；其次，鏈球菌代謝背景不夠清晰，利用分子手段改造較為困難；最后，獸疫鏈球菌生物發酵產生的透明質酸分子量較高，不適用于直接添加到化妝品或保健品中。因此，開發更加經濟、安全且分子量低的生產透明質酸基因工程菌株具有重要的意義。

3、構建生產透明質酸的基因工程菌株需要引入透明質酸合成酶，迄今為止，透明質酸已經在大腸桿菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌等多種微生物中實現了異源合成。但目前，低分子量透明質酸的基因工程菌株生物發酵生產產量較低、發酵工藝較為繁瑣。因此，構建一株高產低分子量透明質酸的基因工程菌株成為本領域迫切需要解決的一個技術問題。

技術實現思路

1、針對現有技術的不足，本發明提供了一種透明質酸重組菌的構建及其應用。

2、本發明構建的重組谷氨酸棒桿菌，在食品安全級微生物谷氨酸棒桿菌中構建表達低分子量透明質酸的合成途徑，實現從葡萄糖一步生產透明質酸的基礎上，調控前體物質積累，弱化競爭途徑，提高了低分子量透明質酸的產量。

3、本發明的技術方案如下：

4、一種重組谷氨酸棒桿菌，含有透明質酸合酶基因hasa、udp-葡萄糖脫氫酶基因udga2、谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉氨酶基因glms，宿主菌為谷氨酸棒桿菌；

5、透明質酸合酶基因hasa的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；

6、udp-葡萄糖脫氫酶基因udga2的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；

7、谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉氨酶基因glms的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

8、根據本發明優選的，宿主菌為谷氨酸棒桿菌atcc13032。

9、根據本發明優選的，所述重組谷氨酸棒桿菌中的質粒載體為pec-xk99e和/或pxmj19。

10、根據本發明優選的，所述重組谷氨酸棒桿菌中，透明質酸合酶基因hasa、udp-葡萄糖脫氫酶基因udga2、谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉氨酶基因glms連接到質粒pec-xk99e中，為重組質粒pec-xk99e-hasa-udga2-glms；

11、所述透明質酸合酶基因hasa、udp-葡萄糖脫氫酶基因udga2、谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉氨酶基因glms分別連接有序列rbs1、rbs2、rbs3；

12、rbs1的核苷酸序列如seq?id?no.11所示、rbs2的核苷酸序列如seq?id?no.12所示、rbs3的核苷酸序列如seq?id?no.13所示。

13、根據本發明優選的，所述重組谷氨酸棒桿菌中，還含有dcas9蛋白基因dcas9，以及基因sgrna1、sgrna2、sgrna3、sgrna4、sgrna5、sgrna6中的任一種；

14、dcas9蛋白基因dcas9的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；

15、sgrna1的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；

16、sgrna2的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；

17、sgrna3的核苷酸序列如seq?id?no.7所示；

18、sgrna4的核苷酸序列如seq?id?no.8所示；

19、sgrna5的核苷酸序列如seq?id?no.9所示；

20、sgrna6的核苷酸序列如seq?id?no.10所示。

21、進一步優選的，dcas9蛋白基因dcas9與sgrna1、sgrna2、sgrna3、sgrna4、sgrna5、sgrna6中的任一種連接到質粒pxmj19中，分別為重組質粒pxmj19-dcas9-ostasgrna1、pxmj19-dcas9-ostasgrna2、pxmj19-dcas9-ostasgrna3、pxmj19-dcas9-treysgrna4、pxmj19-dcas9-treysgrna5或pxmj19-dcas9-treysgrna6。

22、更優選的，所述重組谷氨酸棒桿菌中，dcas9蛋白基因dcas9與sgrna1連接到質粒pxmj19中，為重組質粒pxmj19-dcas9-ostasgrna1。

23、一株谷氨酸棒桿菌(corynebacterium?glutamicum)ha-z01，2024年11月26日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏編號為cctcc?no：m20242640。

24、上述重組谷氨酸棒桿菌的構建方法，包括如下步驟：

25、(1)基于谷氨酸棒桿菌的密碼子偏好性，設計得到透明質酸合酶的基因序列hasa，如seq?id?no.1所示；設計上游引物hasa-f?seq?id?no.14和下游引物hasa-r?seq?idno.15，進行聚合酶鏈式反應，擴增獲得rbs1-hasa基因；

26、(2)將質粒pec-xk99e分別進行ecorⅰ與sacⅰ雙酶切，制得線性化質粒，將線性化質粒與步驟(1)得到的rbs1-hasa基因通過無縫克隆進行連接，將連接產物轉化宿主菌e.colijm109感受態細胞，進行篩選并提取質粒，得到重組質粒pec-xk99e-hasa；

27、(3)以udga2-f?seq?id?no.16和udga2-r?seq?id?no.17為上下游引物，以谷氨酸棒桿菌atcc13869基因組dna為模板或者seq?id?no.2為模板，進行聚合酶鏈式反應，獲得udp-葡萄糖脫氫酶rbs2-udga2基因序列；

28、(4)將步驟(2)得到的重組質粒pec-xk99e-hasa，分別進行sacⅰ與kpnⅰ雙酶切，制得線性化質粒，將線性化質粒與步驟(3)得到的rbs2-udga2基因通過無縫克隆進行連接，將連接產物轉化宿主菌e.coli?jm109感受態細胞，進行篩選并提取質粒，得到重組質粒pec-xk99e-hasa-udga2；

29、(5)基于谷氨酸棒桿菌的密碼子偏好性，設計得到谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉氨酶的基因序列glms，如seq?id?no.3所示；以glms-f?seq?id?no.18和glms-rseq?id?no.19為上下游引物，進行聚合酶鏈式反應，獲得rbs3-glms基因；

30、(6)將步驟(4)得到的重組質粒pec-xk99e-hasa-udga2，分別進行kpnⅰ與bamhⅰ雙酶切，制得線性化質粒，將線性化質粒與步驟(5)得到的rbs3-glms基因通過無縫克隆進行連接，將連接產物轉化宿主菌e.coli?jm109感受態細胞，進行篩選并提取質粒進行pcr及測序驗證，得到重組質粒pec-xk99e-hasa-udga2-glms；

31、(7)將步驟(6)得到的重組質粒pec-xk99e-hasa-udga2-glms轉化谷氨酸棒桿菌atcc13032中，篩選獲得轉化有pec-xk99e-hasa-udga2-glms質粒的基因工程菌。

32、根據本發明優選的，所述構建方法中，還包括：將質粒pxmj19分別進行hindⅲ與salⅰ雙酶切，制得線性化質粒，將線性化質粒與dcas9基因如seq?id?no.4所示，通過無縫克隆進行連接，將連接產物轉化宿主菌e.coli?jm109感受態細胞，進行篩選并提取質粒，得到重組質粒pxmj19-dcas9；

33、設計osta基因不同干擾強度的sgrna序列，分別為sgrna1、sgrna2和sgrna3基因片段；

34、sgrna1的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；

35、sgrna2的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；

36、sgrna3的核苷酸序列如seq?id?no.7所示；

37、將重組質粒pxmj19-dcas9進行bamhⅰ與kpnⅰ雙酶切，制得線性化質粒，將線性化質粒分別與sgrna1、sgrna2和sgrna3基因片段通過無縫克隆進行連接，將連接產物轉化宿主菌e.coli?jm109感受態細胞，進行篩選并提取質粒，分別得到重組質粒pxmj19-dcas9-ostasgrna1、pxmj19-dcas9-ostasgrna2和pxmj19-dcas9-ostasgrna3；

38、設計trey基因不同干擾強度的sgrna序列，分別為sgrna4、sgrna5和sgrna6基因片段；

39、sgrna4的核苷酸序列如seq?id?no.8所示；

40、sgrna5的核苷酸序列如seq?id?no.9所示；

41、sgrna6的核苷酸序列如seq?id?no.10所示；

42、將重組質粒pxmj19-dcas9進行bamhⅰ與kpnⅰ雙酶切，制得線性化質粒，將線性化質粒分別與sgrna5、sgrna6和sgrna7基因片段通過無縫克隆進行連接，將連接產物轉化宿主菌e.coli?jm109感受態細胞，進行篩選并提取質粒，分別得到重組質粒pxmj19-dcas9-treysgrna4、pxmj19-dcas9-treysgrna5和pxmj19-dcas9-treysgrna6；

43、分別將重組質粒pxmj19-dcas9-ostasgrna1、pxmj19-dcas9-ostasgrna2、pxmj19-dcas9-ostasgrna3、pxmj19-dcas9-treysgrna4、pxmj19-dcas9-treysgrna5和pxmj19-dcas9-treysgrna6轉化步驟(7)得到的含有pec-xk99e-hasa-udga2-glms質粒的基因工程菌，分別篩選獲得轉化有pxmj19-dcas9-ostasgrna1、pxmj19-dcas9-ostasgrna2、pxmj19-dcas9-ostasgrna3、pxmj19-dcas9-treysgrna4、pxmj19-dcas9-treysgrna5或pxmj19-dcas9-treysgrna6質粒的基因工程菌cgha-z01、cgha-z02、cgha-z03、cgha-z04、cgha-z05或cgha-z06。

44、上述重組谷氨酸棒桿菌在生產透明質酸中的應用。

45、根據本發明優選的，所述透明質酸分子量為104-106da。

46、上述重組谷氨酸棒桿菌發酵生產透明質酸的方法，包括如下步驟：

47、將所得的基因工程菌接種于bhi液體培養基中，28-32℃、150-250rpm條件下培養8-16h，得到一級種子液；將一級種子液以初始od562在0.05-0.15之間接入二級種子培養基，在28-32℃、150-250rpm條件下培養8-12h，得到二級種子液；將二級種子液以初始od562為0.05-0.15接入發酵培養基，在28-32℃、150-250rpm條件下培養2-6h，加入iptg終濃度0.1-0.8mm，繼續培養發酵24-84h，去除菌體即得到含有透明質酸的發酵液。

48、根據本發明優選的，bhi液體培養基的組分包括：酵母粉2.5g/l，蛋白胨5g/l，氯化鈉5g/l，牛腦心浸液18.5g/l，30mg/l硫酸卡那霉素和15mg/l氯霉素。

49、根據本發明優選的，二級種子培養基的組分包括：葡萄糖20g/l，硫酸銨10g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，玉米漿粉10g/l，硫酸鎂0.5g/l，磷酸氫二鉀1.5g/l，磷酸二氫鉀1.5g/l，ph＝7。

50、根據本發明優選的，發酵培養基的組分包括：葡萄糖50g/l，硫酸銨15g/l，蛋白胨5g/l，酵母粉2.5g/l，玉米漿粉10g/l，硫酸鎂0.5g/l，磷酸氫二鉀1.5g/l，磷酸二氫鉀1.5g/l，ph＝7。

51、根據本發明優選的，所述發酵液中透明質酸產量達50g/l以上。

52、根據本發明優選的，所述方法生產的透明質酸分子量為104-106da。

53、上述重組谷氨酸棒桿菌生產的透明質酸、上述構建方法構建的重組谷氨酸棒桿菌生產的透明質酸或上述生產透明質酸的方法生產的透明質酸在食品領域、藥品領域或化妝品領域制備含有透明質酸的產品中的應用。

54、本發明的有益效果至少包含如下：

55、本發明采用了分子生物學方法和技術，根據谷氨酸棒桿菌密碼子偏好重新設計并化學合成透明質酸合酶hasa基因序列seq?id?no.1、udp-葡萄糖脫氫酶udga2基因序列seqid?no.2和谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉氨酶glms基因序列seq?id?no.3，同時過表達以上三個基因可以實現透明質酸的高產，在此基礎上，改造谷氨酸棒桿菌的分枝菌酸外層結構(海藻糖以糖脂的形式組成分枝菌酸層)，削弱分支菌酸在高濃度葡萄糖的條件下合成葡萄糖分支菌酸的能力，與此同時不會對菌株生長造成影響，使更多碳源流向透明質酸的生物合成，使透明質酸的產量正向提升。本發明方法中谷氨酸棒桿菌宿主對人和動物均無致病性，為食品級安全微生物，合成的透明質酸產量高，達到50g/l以上，并且透明質酸分子量低，具有良好的產業化應用前景。