本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于治療急性腎損傷的凋亡囊泡及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、急性腎損傷(aki)是世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，具有較高的發(fā)病率。流行病學(xué)研究顯示，每年約1300萬(wàn)人發(fā)生急性腎損傷，約170萬(wàn)人死于急性腎損傷及其并發(fā)癥。aki的特征為短時(shí)間內(nèi)腎功能急劇下降，血肌酐水平迅速增加和/或尿量減少，手術(shù)、休克、敗血癥、藥物毒性等均可能引發(fā)aki。近年來(lái)，隨著重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)如透析等的廣泛開(kāi)展，aki患者的死亡率有所下降。但是，透析等治療手段雖能緩解急性腎損傷，卻不能改善aki后慢性腎臟損傷和慢性腎臟病(ckd)風(fēng)險(xiǎn)。因此，開(kāi)發(fā)新型療法降低腎損傷及其遠(yuǎn)期風(fēng)險(xiǎn)，具有重要科學(xué)價(jià)值和臨床意義。
2、間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)是一類(lèi)低分化狀態(tài)的成體干細(xì)胞，具有自我更新、自我復(fù)制、無(wú)限增殖及多向分化潛能。已有大量研究發(fā)現(xiàn)mscs移植在多種腎損傷模型中，如給小鼠腎臟缺血再灌注損傷模型注射外源性的mscs，顯示出一定腎保護(hù)作用。但是，近年來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性注射的mscs大多被肺部等主要器官的毛細(xì)血管網(wǎng)截留，并在那里發(fā)生凋亡。如靜脈注射mscs到小鼠體內(nèi)，給藥后24小時(shí)肺和肝臟中僅發(fā)現(xiàn)死亡的mscs。此外，研究報(bào)道凋亡的間充質(zhì)干細(xì)胞mscs(dmscs)同樣可以發(fā)揮治療作用。如在刀豆球蛋白a(cona)所致急性肝損傷小鼠模型中，dmscs顯示出與mscs類(lèi)似的降低肝細(xì)胞壞死和肝臟炎癥因子表達(dá)的功能。這些研究表明，mscs移植治療腎損傷的作用可能主要依賴(lài)于旁分泌途徑，如細(xì)胞因子和細(xì)胞外囊泡(ev)等。
3、ev是由細(xì)胞釋放的各種具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡統(tǒng)稱(chēng)，根據(jù)大小和生物發(fā)生途徑可分為外泌體(30-100nm)、微泡(50-1000nm)和凋亡小體(1000-5000nm)等亞型。間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡(msc-ev)已在多種腎臟疾病模型中展現(xiàn)出潛在腎保護(hù)作用。如課題組前期研究顯示，靜脈注射msc-ev模型可顯著改善腎缺血再灌注aki小鼠腎功能，降低血肌酐/尿素氮，抑制腎臟細(xì)胞凋亡、炎癥因子和腎損傷標(biāo)志物表達(dá)，促進(jìn)血管新生，從而緩解aki向ckd轉(zhuǎn)歸。凋亡囊泡(apoev)是由凋亡細(xì)胞釋放的一種細(xì)胞外囊泡，其尺寸、密度和組分等與外泌體和微泡不同。基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，ev主要包括與細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、免疫反應(yīng)和細(xì)胞黏附功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，但apoev富含與細(xì)胞行為和代謝、運(yùn)輸和各種疾病調(diào)節(jié)有關(guān)的許多功能蛋白質(zhì)。此外，apoev的膜分子成分不僅具有ev常見(jiàn)的標(biāo)記物，如cd9、cd63和cd81，而且還具有普遍存在的凋亡標(biāo)記物磷脂酰絲氨酸(ps)和c1q。mscs來(lái)源的apoev高度表達(dá)msc陽(yáng)性標(biāo)記物cd29、cd44和cd90，低表達(dá)陰性標(biāo)志物cd34和cd45。與msc-exo相比，mscs來(lái)源的apoev的產(chǎn)量更高。研究表明，星形孢菌素(sts)誘導(dǎo)mscs凋亡產(chǎn)生的囊泡數(shù)量是正常mscs產(chǎn)生的囊泡的5倍以上。以上研究結(jié)果表明，mscs來(lái)源的apoev含有與msc-exo等不同的生物信息，可能具有潛在的治療作用。
4、研究報(bào)道，mscs來(lái)源的apoev在多種疾病動(dòng)物模型如免疫性疾病、骨質(zhì)疏松癥、皮膚損傷中展現(xiàn)出一定治療作用和應(yīng)用前景。如mscs衍生的apoev輸注可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向抗炎表型轉(zhuǎn)化，恢復(fù)肝臟巨噬細(xì)胞穩(wěn)態(tài)并對(duì)抗2型糖尿病(t2dm)。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型(mrl/lpr小鼠模型)和膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型(cia)中，msc-apoev通過(guò)以劑量依賴(lài)性方式抑制效應(yīng)t細(xì)胞活化和il-2分泌來(lái)直接調(diào)節(jié)t細(xì)胞活性，有效改善細(xì)胞凋亡缺陷小鼠模型中的狼瘡和關(guān)節(jié)炎。在組織再生方面，mscs來(lái)源的apoev可激活皮膚和毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞中的wnt信號(hào)通路，從而促進(jìn)傷口愈合和毛發(fā)生長(zhǎng)。在beagle犬牙髓原位再生模型中，人乳牙髓干細(xì)胞(hdpsc)衍生的apoev招募內(nèi)源性?xún)?nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管生成和牙髓再生。以上研究提示，基于mscs來(lái)源apoev的療法具有強(qiáng)大的組織再生和免疫調(diào)節(jié)作用。但是目前，mscs來(lái)源的凋亡囊泡在腎臟保護(hù)方面的作用及機(jī)制研究目前還未見(jiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、基于此，本發(fā)明提供了一種用于治療急性腎損傷的凋亡囊泡的制備方法。
2、一種用于治療急性腎損傷的凋亡囊泡的制備方法，包括以下步驟：獲取間充質(zhì)干細(xì)胞，傳代至p3～p5，然后誘導(dǎo)凋亡，12～20小時(shí)后收集上清液，通過(guò)差速離心獲得所述凋亡囊泡。
3、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，來(lái)源于鼠科動(dòng)物。
4、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述鼠科動(dòng)物為大鼠。
5、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述誘導(dǎo)凋亡使用的試劑為星形孢菌素溶液，溶劑為二甲基亞砜。
6、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述星形孢菌素溶液的濃度為400～600nm。
7、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述差速離心的步驟為：250～350g離心10～20分鐘去除細(xì)胞，1800～2200g離心10～20分鐘去除細(xì)胞碎片，115000～125000g離心60～80分鐘收集沉淀獲得所述凋亡囊泡。
8、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述凋亡囊泡的直徑為100～300nm。
9、本發(fā)明還提供了一種用于治療急性腎損傷的凋亡囊泡，其根據(jù)如上所述的制備方法制備得到。
10、本發(fā)明還提供了如上所述的凋亡囊泡在制備用于治療急性腎損傷的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
11、本發(fā)明還提供了一種用于治療急性腎損傷的藥物，其包含如上所述的凋亡囊泡，以及藥學(xué)上可接受的輔料。
12、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述藥物的劑型為注射劑。
13、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述急性腎損傷由鉑類(lèi)抗腫瘤藥物引起。
14、本發(fā)明的有益效果為：
15、本發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的凋亡囊泡(apoevs)可顯著改善順鉑誘導(dǎo)的小鼠的急性腎損傷；apoevs具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以減少炎癥和促進(jìn)抗炎反應(yīng)，減輕急性腎損傷，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而修復(fù)腎損傷。本藥物與現(xiàn)有藥物msc相比，具有以下優(yōu)勢(shì)：1、低免疫原性：apoev療法相較于msc療法具有更低的免疫原性，這意味著它們?cè)谝浦矔r(shí)不容易引起宿主的免疫排斥反應(yīng)。2、易于存儲(chǔ)：由于它們的尺寸小，普遍小于200nm，產(chǎn)品可以通過(guò)過(guò)濾進(jìn)行滅菌，整體處理和儲(chǔ)存不如細(xì)胞復(fù)雜。3、適合藥物遞送：apoevs可以被設(shè)計(jì)用于藥物遞送，這為治療提供了更多的靈活性和精確性。4、ev缺乏自我復(fù)制潛力，這在細(xì)胞療法中可能導(dǎo)致腫瘤形成。
1.一種用于治療急性腎損傷的凋亡囊泡的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：獲取間充質(zhì)干細(xì)胞，傳代至p3～p5，然后誘導(dǎo)凋亡，12～20小時(shí)后收集上清液，通過(guò)差速離心獲得所述凋亡囊泡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，來(lái)源于鼠科動(dòng)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述鼠科動(dòng)物為大鼠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)凋亡使用的試劑為星形孢菌素溶液，溶劑為二甲基亞砜。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述星形孢菌素溶液的濃度為400～600nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述差速離心的步驟為：250～350g離心10～20分鐘去除細(xì)胞，1800～2200g離心10～20分鐘去除細(xì)胞碎片，115000～125000g離心60～80分鐘收集沉淀獲得所述凋亡囊泡。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述凋亡囊泡的直徑為100～300nm。
8.一種用于治療急性腎損傷的凋亡囊泡，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到。
9.權(quán)利要求8所述的凋亡囊泡在制備用于治療急性腎損傷的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10.一種用于治療急性腎損傷的藥物，其特征在于，包含權(quán)利要求8所述的凋亡囊泡，以及藥學(xué)上可接受的輔料。