本發明涉及基因工程，尤其是指一種雙菌耦合發酵高產唾液酸乳糖的方法。

背景技術：

1、3'-唾液酸乳糖(3'-sl)是一種存在于母乳中的多功能低聚糖，是由唾液酸通過α-1，3糖苷鍵直接與乳糖連接構成。3'-唾液酸乳糖的合成方法包括提取法、化學合成法以及生物合成法。提取法雖然可確保3'-唾液酸乳糖天然結構不被破環，但母乳獲得困難，提取法不能實現規模化生產。化學合成法雖然可以指導大規模生產，但反應過程復雜，3'-唾液酸乳糖收率低。構建工程微生物，利用生物合成法可以克服上述缺點，但如何更加高效生產3'-唾液酸乳糖還需進一步研究。全細胞生物催化是用于天然化合物生產的最簡單最古老的催化方法之一。采用全細胞生物催化系統不需要將酶進行純化，細胞作為載體可包含一系列酶，大大降低了工業應用的生產成本。除此之外，使用真菌和細菌等微生物是一種可持續的生產方法，而且細胞本身就能提供輔因子，不需要再另外補充。

2、生產成本昂貴以及生產效率低是目前3'-唾液酸乳糖實現規模化高效生產所面對的主要問題。當前3'-唾液酸乳糖的生產是以唾液酸或葡萄糖為底物進行發酵合成，然而以唾液酸為底物時其生產成本較高，以葡萄糖為底物時3'-唾液酸乳糖的生產效率較低。當前3'-唾液酸乳糖的發酵最高產量是在5l生物反應器中達到了56.8g/l，這一成果創下了目前該領域的最高紀錄，但是對于工業生產來說，其生產成本以及生產效率仍然無法滿足工業需求。

技術實現思路

1、為此，本發明所要解決的技術問題在于克服現有技術中3'-唾液酸乳糖生產成本高且生產效率低的問題。

2、為解決上述技術問題，本發明提供了一種雙菌耦合發酵高產唾液酸乳糖的方法。針對生產成本昂貴的問題，本發明使用更為廉價的n-乙酰氨基葡萄糖為底物，先經過兩步合成重要前體唾液酸，再利用乳糖兩步合成3'-唾液酸乳糖。唾液酸和乳糖合成3'-唾液酸乳糖的過程中需要胞苷5'-三磷酸(ctp)的參與，但ctp的價格較高，若大量加入ctp必然會使生產成本提高。本發明使用釀酒酵母參與3'-唾液酸乳糖的合成，酵母體內含有豐富的酶系，可以在不消耗乳糖的前提下將較為廉價的胞苷-5'-單磷酸(cmp)轉化為ctp，減少大腸桿菌的改造步驟，降低大腸桿菌代謝壓力，也可有效降低生產成本。除此以外，本發明還優化了誘導條件和發酵條件，因此通過本發明的雙菌耦合發酵后3'-唾液酸乳糖的產量高達78.03g/l，遠高于現有產量。

3、本發明的第一個目的是提供了一種雙菌耦合發酵高產唾液酸乳糖的方法，將酵母菌和重組菌接種于以n-乙酰氨基葡萄糖、丙酮酸、乳糖為底物的發酵體系中耦合發酵合成所述3'-唾液酸乳糖，其中，所述重組菌過表達n-乙酰氨基葡萄糖2-酰亞胺酶、n-乙酰神經氨酸酶、胞苷-5'-單磷酸-唾液酸合成酶和α-2，3唾液酸轉移酶。

4、進一步地，編碼所述n-乙酰氨基葡萄糖2-酰亞胺酶的基因ce_3其核苷酸序列如seq?id?no.1所示，編碼所述n-乙酰神經氨酸酶的基因nana其核苷酸序列如seq?id?no.2所示，編碼所述cmp-neu5ac合成酶的基因neua其核苷酸序列如seq?id?no.3所示，編碼所述α-2，3唾液酸轉移酶的基因nst3其核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

5、進一步地，seq?id?no.1的序列如下所示：

6、atggacttcaagaaactggctaaccagtaccgcgatgaactgctggacaacgttctgccgttctggctggagcacagccaggatctggaattcggtggctatttctcctgtctggaccgtgaaggtaaggtgttcgacaccgataaattcatctggctgcagggtcgcgaagtttggatgttctccatgctgtacaacaaagttgaaaagcgtcaggaatggctggattgcgctgttcagggtggtgaatttctgaaaaaatacggccacgatggcaactataactggtatttctctctggatcgttctggccgcccgctggttgaaccgtataacatcttttcctacactttcgctactatggcctttggtcagctgtccctggcaactggtaaccaggaatacgcagacattgccaaaaaaaccttcaaaatcatcctgtctaaagttgataacccaaaatctaaatggaacaaactgcaccctggtacccgtaacctgaagaacttcgccctgccgatgatcctgtgcaacctggccctggaaatcgaacacctgctggatccgggttacctggaacagactatggaaacctgcatccacgaagtgatggacgttttctatcgtccggaactgggcggtattatcgttgagaacgttgatatggacggtaacctggttgattgcttcgaaggccgccaggttactccgggtcacgcaatcgaagccatgtggttcattatggatctgggcaaacgcctgaatcgtccgaaactgattgagaaagcgaaagacgtgactctgactatgctggactacggttgggacaaacaatacggtggtatctattacttcatggatcgcaatggttgtccgccgcagcagctggaatgggaccagaagctgtggtgggttcatatcgaatctctgatcagcctgctgaaaggttaccagctgactggtgaccgtaagtgcctggagtggttcgaaaaggtgcacgactacacctggtcccacttcaaagacccggaatatccggaatggtatggctacctgaaccgtcgtggtgaggttctgctgccgctgaaaggtggtaagtggaaaggttgtttccatgtgccgcgtggtctgttccagtgctggaaagtcctggagccgctgtaa

7、進一步地，seq?id?no.2的序列如下所示：

8、atggctagcgctacttttacgggtgttattccgcctgttatgactccgctgcacgctgatggtagcgtggacgttgaaagcctgcgtaaactggttgatcacctgattaacggtggtgtggacggtctgttcgctctgggctccagcggtgaagctgcattcctgacccgtgcccagcgtaaactggctctgaccaccattatcgaacacaccgctggtcgcgttccggttaccgcaggtgtcatcgaaaccaccactgcgcgtgtgatcgaactggtagaggatgccctggaagcgggtgcagaaggtctggtagccactgcgccattctacactcgcacccacgatgtggaaatcgaagaacacttccgtaaaattcatgcagcagcaccggaactgccgctgtttgcgtacaacattccggtgtctgtgcactctaacctgaatccggttatgctgctgaccctggcaaaggatggcgtcctggctggtactaaagacagctctggcaacgacggtgctatccgttctctgatcgaagctcgtgacgatgcaggcctgaccgagcagtttaagatcctgactggtagcgaaaccactgttgatttcgcatacctggctggtgcggacggtgttgtaccaggtctgggtaacgtggacccggcagcttatgcagcgctggctaagctgtgcctggacggtaaatgggctgaagcggcagcgctgcagaaacgcattaatcatctgttccacatcgttttcgttggtgatacctctcacatgtccggtagctctgcaggtctgggtggtttcaaaactgccctggcccacctgggcattatcgaatctaacgcgatggcggtgcctcatcagtctctgtccgatgaagaaaccgctcgtattcacgcgattgttgatgaattcctgtataccgcgtaa

9、進一步地，seq?id?no.3的序列如下所示：

10、atggaaaaacaaaatattgcggttatacttgcgcgccaaaactccaaaggattgccattaaaaaatctccggaaaatgaatggcatatcattacttggtcatacaattaatgctgctatatcatcaaagtgttttgaccgcataattgtttcgactgatggcgggttaattgcagaagaagctaaaaatttcggtgtcgaagtcgtcctacgccctgcagagctggcctccgatacagccagctctatttcaggtgtaatacatgctttagaaacaattggcagtaattccggcacagtaaccctattacaaccaaccagtccattacgcacaggggctcatattcgtgaagctttttctctatttgatgagaaaataaaaggatccgttgtctctgcatgcccaatggagcatcatccactaaaaaccctgcttcaaatcaataatggcgaatatgcccccatgcgccatctaagcgatttggagcagcctcgccaacaattacctcaggcatttaggcctaatggtgcaatttacattaatgatactgcttcactaattgcaaataattgtttttttatcgctccaaccaaactttatattatgtctcatcaagactctatcgatattgatactgagcttgatttacaacaggcagaaaacattcttaatcacaaggaaagctaa

11、進一步地，seq?id?no.4的序列如下所示：

12、atggtctgaaaaaggtctgtctgacggtcctgtgcctgattgtgttttgcttcggcatcttctatacctttgatcgtgtaaatcagggtgagcgcaacgcggtttctctgctgaaagacaaactgttcaacgaagaaggtaagccggttaatctgattttctgttacaccatcctgcagatgaaggtcgcggaacgtattatggctcagcacccgggtgaacgtttctacgtggttctgatgtccgaaaaccgtaacgagaaatatgactactactttaaccagatcaaagacaaagctgagcgtgcgtattttttttatctgccgtacggtctgaacaaaagcttcaatttcatcccgacgatggctgaactgaaagtaaagtctatgctgctgccgaaggttcgccgtatctacctggcgtctctggaaaaagtatctatcgctgcgttcctgtctacttacccggacgctgagatcaaaaccttcgatgatggtactaacaacctgatccgcgaatcctcctacctgggtggtgaatttgcggtgaacggtgcaatcaagcgcaacttcgcgcgtatgatggttggcgactggtctattgcgaaaacccgtaacgctagcgatgagcattacaccatcttcaaaggcctgaaaaatatcatggacgatggccgtcgcaaaatgacttatctgccgctgttcgacgcaagcgaactgaaagcaggtgacgaaaccggtggtaccgtacgtatcctgctgggttctccagataaggaaatgaaagaaatcagcgaaaaggcagcgaaaaacttcaacatccagtacgttgcgccgcaccctcgtcaaacctatggtctgtccggcgtgaccgccctgaattctccgtacgtgattgaagattatatcctgcgtgaaattaaaaagaacccgcacacccgctacgaaatttacactttcttttctggcgcggcgctgaccatgaaagacttcccgaacgttcacgtttatgctctgaaaccggcgtccctgccagaagactactggctgaaacctgtttatgcactgtttcgtcaggctgacatcccgattctggcgttcgacgacaaaaaccaatctcatggtaaatccaaataa

13、進一步地，所述n-乙酰氨基葡萄糖的添加量為100-500mm。

14、進一步地，所述乳糖的添加量為80-250mm。

15、進一步地，所述酵母的添加量為50-150g/l。

16、進一步地，所述丙酮酸的添加量為300-700mm。

17、進一步地，所述發酵體系中還包括cmp，所述cmp的添加量為10-70mm。

18、進一步地，所述重組菌以大腸桿菌或枯草芽孢桿菌為宿主。

19、進一步地，所述酵母菌選自面包酵母、啤酒酵母和釀酒酵母中的一種或多種。

20、進一步地，將重組菌進行誘導培養，將誘導培養后的重組菌和酵母菌接種于以n-乙酰氨基葡萄糖、丙酮酸、乳糖為底物的發酵體系中耦合發酵合成所述3'-唾液酸乳糖，其中，所述重組菌過表達n-乙酰氨基葡萄糖2-酰亞胺酶、n-乙酰神經氨酸酶、cmp-neu5ac合成酶、α-2，3唾液酸轉移酶，所述誘導培養的溫度為15-35℃，所述誘導培養的時間為10-35小時，所述誘導培養的od值為0.6-1.5。

21、進一步地，所述發酵體系還包括0.5-1.5mm?dtt、15-25ml/l甘油、2.5-7.5g/l乙醛、15-25mm?mgcl2、200-250mm?kh2po4和100-200mm?tris、3-5g/l十八胺聚氧乙烯醚。

22、進一步地，所述耦合發酵的溫度為25-35℃。

23、本發明的有益效果：

24、本發明提供了一種雙菌耦合發酵高產唾液酸乳糖的方法。本發明使用更為廉價的n-乙酰氨基葡萄糖為底物，先經過兩步合成重要前體唾液酸，再利用乳糖兩步合成3'-唾液酸乳糖。同時使用釀酒酵母參與3'-唾液酸乳糖的合成，酵母體內含有豐富的酶系，可以在不消耗乳糖的前提下將較為廉價的胞苷-5'-單磷酸(cmp)轉化為ctp，減少大腸桿菌的改造步驟，降低大腸桿菌代謝壓力，也可有效降低生產成本。除此以外，本發明還優化了誘導條件和發酵條件，因此通過本發明的雙菌耦合發酵后3'-唾液酸乳糖的產量高達78.03g/l，遠高于現有產量。