本發明涉及以人工設計的底物微通道原理為指導、通過計算機輔助預測結構來理性設計的ugt91c1-ugt76g1-susy融合酶分子以及在畢赤酵母中高效表達的制備方法，及其在底物循環再生與級聯催化中的應用，屬于生物催化與生物轉化領域。
背景技術：
0、技術背景
1、目前有許多證據表明，過量的糖攝入會導致肥胖、齲齒、高血壓、糖尿病等的疾病，所以尋找一種低熱量、高甜度的代糖成為食品和飲料行業關注的焦點。甜菊糖苷是存在于甜葉菊中的一類物質，它作為天然甜味劑的代表，使用歷史悠久、高甜低熱、性質穩定，它的甜度是蔗糖的250-450倍，但熱量僅為它的0.3％，除了應用在食品行業，還有一定的藥理保健作用。甜菊糖苷是由二萜類甜菊醇主鏈組成的衍生物，側鏈在甜菊醇苷元的c13位置上的羥基和c19位置上的羧基可以糖基化連接不同數量的葡糖基。在甜菊糖苷的組成中，甜菊糖苷(st)和萊鮑迪甘(ra)，分別占5％-10％和2％-5％，是其主要組成成分，但是他們的苦澀后味限制了它們的應用，萊鮑迪甘d(rd)和萊鮑迪甘m(rm)占比極低，僅為0.2％，但其因為沒有苦澀后味，被認為是甜味劑的最佳替代品。
2、ra向rm的轉化是在糖基轉移酶ugt91c1和ugt76g1催化下進行的酶促反應，首先ra在糖基轉移酶ugt9c1催化下在c-13位形成1,2-β-d糖苷鍵生成rd，rd在ugt76g1催化下在c-19位形成1,3-β-d糖苷鍵生成rm，因此利用廉價易得的ra通過ugt91c1與ugt76g1的級聯催化生成rm是一種綠色可行的方法。然而ugt91c1和ugt76g1是兩種依賴udpg的糖基轉移酶，它的催化嚴格依賴第二底物udpg作為糖基供體才能進行，但udpg高昂的價格限制了它的推廣應用，因此如何降低生產成本是酶法合成萊鮑迪甘m實現工業化亟待解決的問題。
3、蔗糖合酶susy是植物體內參與蔗糖代謝的關鍵酶之一，它可以催化蔗糖和尿苷二磷酸(udp)可逆的轉化為果糖和udpg，susy的催化反應避免了udpg復雜的從頭合成途徑，只需要價格相對低廉的udp和蔗糖，便可以實現udpg的一步高效合成，降低了糖供體udpg的獲取成本。當前，已經開發了一些基于ugt91c1和ugt76g1合成rm的應用方法，但是有關糖供體udpg的再生并參與聯合級聯催化反應，特別是基于人工構建的底物微通道原理的ugt91c1-ugt76g1-susy三功能融合酶的構建與制備，未見有專利和文獻報道。ugt91c1-ugt76g1-susy三功能融合酶催化級聯反應，僅添加價格相對低廉的udp和蔗糖就可以進行反應并且實現底物的循環再生，還可以通過人工設計的底物微通道強化中間產物及底物的傳質過程，避免中間產物及底物向主體相擴散，增加中間產物及底物在催化中心附近的局部濃度，同時三功能酶融合策略使得蛋白表達純化更為簡便，反應體系更為簡單，有著重要的生物催化工業生產前景。
技術實現思路
1、本發明的目的在于提供一種具有高催化性能以及可以實現底物循環再生的ugt91c1-ugt76g1-sssy融合酶分子的構建與重組制備的方法，該融合體系可以利用價格相對低廉的底物進行生物合成，并且可以通過人工設計構建的底物微通道實現底物的高效傳質，避免中間產物以及底物向反應體系擴散，從而實現萊鮑迪甘m的低成本高效合成。
2、為了實現上述目的，本發明涉及的主要實施步驟包括：
3、(1)基于人工設計的底物微通道原理，設計連接肽的序列，使得ugt76g1融合在ugt91c1d的c端，susy融合在ugt76g1的c端。
4、(2)通過連接肽數據庫以及計算機輔助設計，確定ugt91c1與ugt76g1之間通過(eaaak)3連接，ugt76g1與susy之間通過(ggggs)4連接。
5、(3)ugt91c1-ugt76g1-sssy融合酶基因及表達載體的構建；
6、(4)ugt91c1-ugt76g1-sssy融合酶重組質粒的轉化及其在畢赤酵母中的表達純化；
7、(5)ugt91c1-ugt76g1-sssy融化酶催化級聯反應的表征。
8、本發明所構建的ugt91c1-ugt76g1-susy融合酶的基因序列為seq?id?no.1，相應的基因命名為ugt76g1-ugt91c1-susy。
9、所構建的融合酶的蛋白質以及序列為seq?id?no.2
10、本發明涉及的步驟(1)中的ugt91c1和ugt76g1為整合了催化性能較好的突變位點的突變序列，其中ugt91c1突變了f208m，ugt76g1突變了m88l、l200a、t284s，但也可以為野生型序列或其它突變體。
11、本發明涉及的步驟(2)中的連接肽為eaaak、ggggs，但不限于這兩種。
12、本發明涉及的步驟(3)中使用的質粒為ppicza，但不限于這一種。
13、本發明涉及的步驟(4)中使用的重組表達體系為畢赤酵母、大腸桿菌，但不限于這兩種。
14、本發明涉及的步驟(5)中采用高效液相色譜法來檢測酶活，但不限于這一種。
15、與現有的技術相比，本發明的有益效果包括：(1)基于人工設計的底物微通道原理、連接肽數據庫篩選、計算機輔助設計，對融合酶的融合順序以及連接肽進行合理設計；(2)與單獨表達ugt91c1、ugt76g1、susy的游離酶混合體系相比，融合酶的表達純化更為簡便，更有利于工業化生產；(3)susy可以利用相對廉價的udp和蔗糖合成udpg并用于ugt91c1和ugt76g1催化進行的級聯反應，大大降低了生產成本；(4)融合酶催化的級聯反應可以借助人工設計的底物微通道及時地將中間產物進行轉化，增強傳質效率，避免了中間產物的積累及向反應主體擴散，提高了催化效率；(5)為其它類似的需要昂貴的udpg作為糖基供體的反應提供了綠色經濟的解決方案；(6)為其它融合酶的構建及改造提供借鑒。
1.一種基于人工設計的底物微通道原理及底物循環再生體系構建的多功能融合酶體系構建與制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的基于人工設計的底物微通道原理及底物循環再生體系構建的多功能融合酶體系構建與制備方法，其特征在于，其基因序列和蛋白一級結構分別為：seqid?no.1和seq?id?no.2。
3.根據權利要求2所述的基于人工設計的底物微通道原理及底物循環再生體系構建的多功能融合酶體系構建與制備方法，其特征在于，步驟1中的ugt91c1和ugt76g1為整合了催化性能較好的突變位點的突變序列，其中ugt91c1突變了f208m，ugt76g1突變了m88l、l200a、t284s，但也可以為野生型序列或其它突變體。
4.根據權利要求3所述的基于人工設計的底物微通道原理及底物循環再生體系構建的多功能融合酶體系構建與制備方法，其特征在于，步驟2中的連接肽為eaaak、ggggs，但不限于這兩種。
5.根據權利要求4所述的基于人工設計的底物微通道原理及底物循環再生體系構建的多功能融合酶體系構建與制備方法，其特征在于，步驟3中使用的質粒為ppicza，但不限于這一種。
6.根據權利要求5所述的基于人工設計的底物微通道原理及底物循環再生體系構建的多功能融合酶體系構建與制備方法，其特征在于，步驟4中使用的重組表達體系為畢赤酵母、大腸桿菌，但不限于這兩種。
7.根據權利要求6所述的基于人工設計的底物微通道原理及底物循環再生體系構建的多功能融合酶體系構建與制備方法，其特征在于，步驟5中采用高效液相色譜法來檢測酶活，但不限于這一種。
8.根據權利要求7所述的基于人工設計的底物微通道原理及底物循環再生體系構建的多功能融合酶體系構建與制備方法，其特征在于，利用人工設計的底物微通道原理，以及構建底物循環再生體系，用于綠色經濟高效的制備甜菊糖苷，不僅可以強化中間產物及底物的傳質過程，避免中間產物及底物向主體相擴散，推動級聯反應相底物方向加速進行，還可以利用相對廉價的原材料進行催化，有著重要的生物催化工業生產前景。