本發明涉及生物工程，具體而言，涉及一種重組表達載體、重組菌、大麻二酚類似物o-1821合成方法及其應用。
背景技術：
1、大麻素是源于植物大麻(cannabis?sativa)的一類次生代謝產物的總稱，其在醫學領域的潛力已被廣泛研究。大麻素因其在緩解疼痛、抑制炎癥、減輕焦慮、治療癲癇和代謝疾病等方面的顯著效果，逐漸成為藥物研發的熱點。其中，o-1821(也稱為cannabidiorcol、cbdo或cbd-c1)是大麻二酚(cbd)的一種結構類似物。o-1821表現出對大麻素受體(cb)的較低親和力，但作為瞬時受體電位通道(trp通道)的激動劑，能夠通過多種信號通路發揮抗炎作用。此外，o-1821在神經保護和抗氧化方面也顯示出潛在療效。然而，已有研究表明，高濃度的o-1821可能會促進腫瘤的發生，提示需要更加精準的劑量調控與應用探索。
2、大麻根霉酸(cannabigerorcinic?acid,cbgoa)和苔色酸(orsellinic?acid，osa)是o-1821的兩個關鍵前體化合物，二者均具有重要的藥理特性。苔色酸作為一種天然化合物，已被證實具有抗氧化、神經保護等生物學活性。大麻根霉酸則因其獨特的化學結構和功能，在大麻素合成及藥物研發中具有潛在應用價值。然而，傳統通過植物提取方式獲取這些大麻素及其前體的工藝，受制于高昂的成本、有限的資源供給以及周期性生產的不確定性，極大限制了其工業化生產和廣泛藥用開發。
3、微生物代謝工程的發展為大麻素的可持續生產提供了新的解決方案。通過設計合成特定的代謝通路，微生物細胞工廠能夠在控制條件下高效生產目標化合物。尤其是非傳統微生物平臺的應用，為突破傳統生產的瓶頸提供了全新的可能性。
4、解脂耶氏酵母(yarrowia?lipolytica)是一種具有高脂肪酸代謝能力和遺傳工程靈活性的非傳統酵母。與傳統模式微生物(如釀酒酵母)相比，解脂耶氏酵母在丙二酰輔酶a(malonyl-coa)和異戊二烯焦磷酸(ipp)通量上具有顯著優勢，使其成為復雜天然產物(如大麻素)生物合成的理想平臺。然而，目前利用解脂耶氏酵母合成大麻素及其類似物的研究仍處于起步階段，特別是針對o-1821及其前體化合物(如大麻根霉酸和苔色酸)的高效生產研究尚屬空白，阻礙了這些高附加值化合物在醫藥領域的開發與應用。
5、鑒于此，特提出本發明。
技術實現思路
1、本發明的目的在于提供一種重組表達載體、重組菌、大麻二酚類似物o-1821合成方法及其應用，以推動大麻素類藥物的產業化進程和臨床應用前景。
2、本發明是這樣實現的：
3、第一方面，本發明提供了一種重組表達載體，其包括：第一表達載體、第二表達載體和第三表達載體；
4、所述第一表達載體包括苔色酸合成酶armb基因；所述第二表達載體包括來源于植物大麻的異戊烯基轉移酶tcspt4基因和來源于鏈霉菌的異戊烯基轉移酶nphb(y288a/g286s)突變體基因；所述第三表達載體包括來源于植物大麻的大麻二酚酸合酶突變體cbdas(g183v/n482w)基因。
5、第二方面，本發明還提供了一種重組菌或重組細胞，其包括上述的重組表達載體。
6、第三方面，本發明還提供了重組表達載體或上述的重組菌或重組細胞在大麻二酚類似物o-1821合成、大麻根霉酸或苔色酸合成中的應用。
7、第四方面，本發明還提供了一種大麻二酚類似物o-1821的合成方法，其包括如下步驟：其包括如下步驟：將上述的重組表達載體轉化底盤菌株，并對轉化后的菌中的選擇標記進行消除，篩選獲得重組菌；培養所述重組菌或培養上述的重組菌。
8、第五方面，本發明還提供了一種解脂耶氏酵母工程菌株的構建方法，構建方法包括：
9、將上述的重組表達載體轉染解脂耶氏酵母菌株的感受態細胞，培養得到陽性轉化子。
10、本發明具有以下有益效果：
11、本發明通過模塊化代謝工程和基因優化設計，重建解脂耶氏酵母內的大麻二酚類似物o-1821及其前體大麻根霉酸和苔色酸從頭合成途徑，實現以上產物在酵母中的生物合成。本發明提供的重組表達載體，該重組表達載體轉染至底盤菌株的感受態細胞后可實現苔色酸合成酶基因、來源于植物大麻的異戊烯基轉移酶tcspt4基因、來源于鏈霉菌的異戊烯基轉移酶nphb(y288a/g286s)突變體基因和來源植物大麻的大麻二酚酸合酶突變體cbdas(g183v/n482w)基因的共表達，實現o-1821及其前體大麻根霉酸和苔色酸的從頭合成。首先，可通過優化內源性丙二酰輔酶a和香葉基二磷酸(gpp)的代謝通量，增強了關鍵酶的催化效率。其次，引入了凝聚相囊泡狀酶活性濃縮體-雙異戊烯基轉移酶協同表達系統，協同表達雙異戊烯基轉移酶(tcspt4和nphb)，顯著提高了苔色酸轉化為大麻根霉酸的效率，實現了o-1821及其前體化合物的高效合成。與設計前的底盤菌株相比，本發明提供的解脂耶氏酵母工程菌株實現了苔色酸、大麻根霉酸和大麻二酚類似物o-1821的從無到有的高效合成，有助于解脂耶氏酵母工程菌株成為復雜天然產物(如大麻素)生物合成的理想平臺，推動了這些高附加值化合物在醫藥領域的開發與應用。
1.重組表達載體，其特征在于，其包括：第一表達載體、第二表達載體和第三表達載體；
2.根據權利要求1所述的重組表達載體，其特征在于，所述苔色酸合成酶的氨基酸序列如seq?id?no.5所示，所述來源于植物大麻的異戊烯基轉移酶tcspt4的氨基酸序列如seqid?no.6所示，所述來源于鏈霉菌的異戊烯基轉移酶nphb(y288a/g286s)突變體的氨基酸序列如seq?id?no.7所示，所述來源于植物大麻的大麻二酚酸合酶突變體cbdas(g183v/n482w)的氨基酸序列如seq?id?no.8所示；
3.根據權利要求2所述的重組表達載體，其特征在于，所述第一表達載體上的所述苔色酸合成酶armb基因的5’端具有啟動子，3’端均具有與所述啟動子相對應的終止子；所述異戊烯基轉移酶tcspt4基因的5’端具有啟動子，3’端均具有與所述啟動子相對應的終止子；所述異戊烯基轉移酶nphb(y288a/g286s)突變體基因的5’端具有啟動子，3’端均具有與所述啟動子相對應的終止子和所述大麻二酚酸合酶突變體cbdas(g183v/n482w)基因的5’端具有啟動子，3’端均具有與所述啟動子相對應的終止子；
4.根據權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，所述表達載體的骨架載體是pylxp或purlp。
5.一種重組菌或重組細胞，其特征在于，其包括權利要求1-4任一項所述的重組表達載體。
6.根據權利要求5所述的重組菌或重組細胞，其特征在于，所述重組菌的底盤菌株為酵母菌；所述重組細胞為重組菌的感受態細胞；
7.如權利要求1-4任一項所述的重組表達載體或權利要求5-6任一項所述的重組菌或重組細胞在大麻二酚類似物o-1821合成、大麻根霉酸或苔色酸合成中的應用。
8.一種大麻二酚類似物o-1821的合成方法，其特征在于，其包括如下步驟：將權利要求1-4任一項所述的重組表達載體轉化亮氨酸leu和尿嘧啶ura雙缺陷型底盤菌株，并對轉化后的菌中的選擇標記進行消除，篩選獲得重組菌；培養所述重組菌或培養權利要求5-6任一項所述的重組菌或重組細胞；
9.一種工程菌株的構建方法，其特征在于，所述構建方法包括：
10.根據權利要求9所述的解脂耶氏酵母工程菌株的構建方法，其特征在于，所述解脂耶氏酵母菌株為尿嘧啶ura和亮氨酸leu雙缺陷型。