本發明屬于植物基因工程，尤其是涉及植物葉綠素水解酶、其變體、其編碼基因及應用。

背景技術：

1、葉綠素是植物光合作用重要物質，決定植物光合作用強弱的關鍵因素，廣泛分布于自然界中。葉綠素降解過程中會產生大量中間產物，如植醇，脫植基葉綠素a，脫鎂葉綠酸a等。這些中間產物既是植物生長發育所必須的物質，同時也是有機化工和醫藥工業等的重要原材料。目前獲取這些中間產物的方法主要有從自然界提取和化學合成兩個，但是這兩種方法都有明顯弊端。雖然自然界中葉綠素含量豐富且易提取，但是其降解的中間產物含量較低，提取效率較低。此外，葉綠素降解過程中產生的中間物質有很多長碳鏈的大分子有機物，所以想通過化學合成得到這些物質成本較高且易造成環境污染。因此通過葉綠素水解酶在體外直接降解葉綠素來獲得其中間產物能極大提高效率。

2、植物中有一個將近600多個成員的abh水解酶家族，這一家族的基因已經被證明能夠在植物體內和體外水解葉綠素和脫鎂葉綠素產生植醇(oster,u.,bauer,c.e.,andrudiger,w.(1997).characterization?of?chlorophyll?a?and?bacteriochlorophyll?asynthases?by?heterologous?expression?in?escherichia?coli.j.biol.chem.272,9671-9676.)。clh(chlorophyllase)是最早發現的葉綠素水解酶，clh可以降解葉綠素和脫鎂葉綠素，但是clh在細胞中并不能靶向葉綠體而是靶向液泡，且clh1clh2雙突變體的種子中葉綠素降解并不受影響(hu,x.,jia,t.,s.,tanaka,a.,and?tanaka,r.(2020).subcellular?localization?of?chlorophyllase2?reveals?it?is?not?involvedin?chlorophyll?degradation?during?senescence?in?arabidopsis?thaliana.plantscience?290,110314.；hu,x.y.,makita,s.,schelbert,s.,sano,s.,ochiai,m.,tsuchiya,t.,hasegawa,s.f.,hortensteiner,s.,tanaka,a.,and?tanaka,r.(2015).reexamination?of?chlorophyllase?function?implies?its?involvement?in?defenseagainst?chewing?herbivores.plant?physiol.167,660-+.)。另一個與衰老相關的葉綠素降解的水解酶pph(pheophytinase)定位于植物葉綠體，但是pph只能特異的降解脫鎂葉綠素，而不能降解自然界含量更豐富的葉綠素a，葉綠素b(schelbert,s.,aubry,s.,burla,b.,agne,b.,kessler,f.,krupinska,k.,and?hortensteiner,s.(2009).pheophytinpheophorbide?hydrolase(pheophytinase)is?involved?in?chlorophyll?breakdownduring?leaf?senescence?in?arabidopsis.plant?cell?21,767-785.；zhang,w.,liu,t.q.,ren,g.d.,hortensteiner,s.,zhou,y.m.,cahoon,e.b.,and?zhang,c.y.(2014).chlorophyll?degradation:the?tocopherol?biosynthesis-related?phytol?hydrolasein?arabidopsis?seeds?is?still?missing.plant?physiol.166,70-79.)。最近幾年，科學家發現了cld1(chlorophyll?dephytylase?1)這一新的abh水解酶，cld1既能降解脫鎂葉綠素也能降解葉綠素a，葉綠素b(lin,y.p.,wu,m.c.,and?charng,y.y.(2016).identification?of?a?chlorophyll?dephytylase?involved?in?chlorophyll?turnoverin?arabidopsis.plant?cell?28,2974-2990.)。

3、專利cn106191082a公開了一種小麥脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶基因tapph，該基因編碼的蛋白質，以及該基因的克隆方法，tapph在小麥不同組織中的表達量不同，其中葉片中最高。黑暗處理以及外源施加植物激素，如脫落酸(abscisic?acid，aba)和乙烯利(ethephon，eth)，tapph的表達量增加。

4、然而現有技術中的葉綠素水解酶的水解活性有待進一步提高。

技術實現思路

1、基于現有技術中葉綠素水解酶的水解活性有待進一步提高的現狀，本發明提供植物葉綠素水解酶、其變體、其編碼基因及應用。

2、具體地，本發明通過進化分析找到了兩個新的葉綠素水解酶cld2與cld3，提供了其相應的變體，同時提供其相應的編碼基因，并提供了葉綠素水解酶去掉轉運肽后的融合蛋白及其制備方法，同時還通過hlpc檢測它們能高效的水解植物葉綠素a，葉綠素b和脫鎂葉綠素，并產生豐富的下游產物，其中cld3的水解活性最高，這些產物可作為原料供給有機化工和醫藥工業等行業使用，具有較高的應用價值。

3、本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

4、本發明首先提供兩個新的植物葉綠素水解酶，為葉綠素水解酶cld2或葉綠素水解酶cld3，其中，葉綠素水解酶cld2序列如seq?id?no.1所示，其由360個氨基酸組成，葉綠素水解酶cld3序列如seq?id?no.2所示，其由379個氨基酸組成。

5、本發明提供的葉綠素水解酶cld2或葉綠素水解酶cld3都屬于α/βhydrolase(abh)水解酶家族。

6、本發明還提供序列如seq?id?no.1所示的酶或序列如seq?id?no.2所示的酶作為植物葉綠素水解酶的應用。

7、本發明提供的葉綠素水解酶cld2或葉綠素水解酶cld3是通過對擬南芥abh家族蛋白進行進化分析，找到的和cld1在進化上親緣關系最近的兩個蛋白cld2和cld3(圖1)。并且在藻類、蕨類、雙子葉和單子葉物種中都具有cld2和cld3，說明這兩個蛋白在植物進化過程中比較保守(圖1)。

8、本發明還進一步提供編碼植物葉綠素水解酶的編碼基因，其中，葉綠素水解酶cld2的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，其由1080個核苷酸組成，葉綠素水解酶cld3的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，其由1137個核苷酸組成。葉綠素水解酶cld2的編碼基因為基因cld2，葉綠素水解酶cld3的編碼基因為基因cld3。

9、本發明提供的編碼植物葉綠素水解酶的編碼基因，除了葉綠素水解酶cld2的編碼基因cld2或葉綠素水解酶cld3的編碼基因cld3本身以外，還包括基因cld2或基因cld3的類似基因以及同源基因。

10、其中，類似基因指的是同基因cld2或基因cld3序列中的任何區域同源性在40％以上(優選為50％以上，更優選為60％以上，更優選為70％以上，更優選為80％以上，更優選為90％以上)的dna片段；類似基因還包括其編碼的氨基酸序列同葉綠素水解酶cld2或cld3的氨基酸序列中任何區域有40％以上(優選為50％以上，更優選為60％以上，更優選為70％以上，更優選為80％以上，更優選為90％以上)的同源率。

11、cld2或基因cld3的同源基因是指與編碼cld1、cld2和cld3的基因在進化關系上同源的其他基因。

12、本發明還進一步提供去掉轉運肽的植物葉綠素水解酶變體，分別為葉綠素水解酶cld2變體或葉綠素水解酶cld3變體，其中，葉綠素水解酶cld2變體的氨基酸序列為seq?idno.1所示序列去掉其第1至55位點片段后的氨基酸序列，葉綠素水解酶cld3變體的氨基酸序列為seq?id?no.2所示序列去掉其第1至54位點片段后的氨基酸序列。

13、本發明還進一步提供編碼植物葉綠素水解酶變體的編碼基因，其中，葉綠素水解酶cld2變體的編碼基因的核苷酸序列為seq?id?no.3所示序列去掉其第1至165位點片段后的核苷酸序列，葉綠素水解酶cld3變體的編碼基因的核苷酸序列為seq?id?no.4所示序列去掉其第1至162位點片段后的核苷酸序列。

14、本發明還提供如seq?id?no.1所示的氨基酸序列去掉其第1至55位點片段后的氨基酸序列對應的酶或如seq?id?no.2所示的氨基酸序列去掉其第1至54位點片段后的氨基酸序列對應的酶作為植物葉綠素水解酶的應用。

15、本發明還進一步提供葉綠素水解酶去掉轉運肽后的融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：

16、利用雙酶切連接法，將編碼植物葉綠素水解酶變體的編碼基因(即不包含轉運肽的clds基因，clds基因指的是基因cld1、cld2和cld3)整合到n端帶有mbp標簽的pmal-c4x載體上，得到重組載體mbp-clds；

17、將重組載體mbp-clds轉化到大腸桿菌菌株中，搖床培養，再加入iptg過夜誘導，得到誘導表達的菌液；

18、離心收集所得誘導表達的菌液，去除上清后加入裂解液充分重懸大腸桿菌，超聲波破碎儀裂解大腸桿菌并釋放目的蛋白，離心，取上清；

19、上清使用beads親和純化出目的蛋白，所述目的蛋白即為葉綠素水解酶去掉轉運肽后的融合蛋白。

20、當植物葉綠素水解酶變體為葉綠素水解酶cld2變體時，目的蛋白表示為mbp-cld2變體。當植物葉綠素水解酶變體為葉綠素水解酶cld3變體時，目的蛋白表示為mbp-cld3變體。

21、本發明提供的目的蛋白除了為mbp-cld2變體或mbp-cld3變體本身以外，還包括mbp-cld2變體或mbp-cld3變體的類似蛋白。

22、mbp-cld2變體或mbp-cld3變體的類似蛋白指的是同葉綠素水解酶cld2變體或cld3變體中的任何區域同源性在40％以上(優選為50％以上，更優選為60％以上，更優選為70％以上，更優選為80％以上，更優選為90％以上)的類似蛋白。

23、在本發明的一個實施方式中，構建mbp-clds載體所用引物如下：

24、葉綠素水解酶cld2變體的編碼基因的引物分別為：

25、fpcgcggatccatgtccgtctcatgttcttccgt

26、rp?cgcgtcgactcaatgtctcgcaacgaatgat

27、葉綠素水解酶cld3變體的編碼基因的引物分別為：

28、fpcgcggatccatggtttcagtcatggatacttcttctg

29、rp?cgcgtcgacttacgtctccaagactataggagaa。

30、在本發明的一個實施方式中，使用beads親和純化出目的蛋白的方法為：

31、首先親和基質加入到上清，孵育，充分結合上清中融合mbp標簽的蛋白，即目的蛋白(也可以稱之為mbp融合蛋白)。接著去上清，將孵育后的親和基質用裂解液沖洗，去掉雜蛋白，加入麥芽糖溶液將mbp融合蛋白從親和基質上洗脫下來。

32、本發明進一步提供去掉轉運肽的植物葉綠素水解酶變體的應用，所述去掉轉運肽的植物葉綠素水解酶變體用于降解葉綠素a，葉綠素b，脫鎂葉綠素及葉綠素a的衍生物，葉綠素b的衍生物，脫鎂葉綠素的衍生物。

33、本發明進一步提供葉綠素水解酶去掉轉運肽后的融合蛋白的應用，所述葉綠素水解酶去掉轉運肽后的融合蛋白用于降解葉綠素a，葉綠素b，脫鎂葉綠素及葉綠素a的衍生物，葉綠素b的衍生物，脫鎂葉綠素的衍生物。

34、本發明公開了兩個新的葉綠素水解酶cld2，cld3，這兩個蛋白也屬于abh家族成員。通過原核表達純化得到高純度去掉轉運肽的cld1，cld2和cld3，進行hlpc(高效液相色譜)分析發現，cld2和cld?3也可以同時降解葉綠素a，葉綠素b和脫鎂葉綠素，并且cld3水解活性最高，其次是cld2，且都比cld1水解活性高。通過hlpc也發現，這三個酶水解葉綠素都可以生成豐富的下游產物，比如植醇，脫植基葉綠素a，脫鎂葉綠酸a，其中cld3還能通過水解葉綠素b得到脫植基葉綠素b。

35、本發明研究發現cld1，cld2和cld3蛋白都可以水解葉綠素a，葉綠素b和脫鎂葉綠素a，且相較于葉綠素a和葉綠素b三個酶對脫鎂葉綠素a的水解活性都最高，對葉綠素b的水解活性都最低。且cld3的水解能力最強，其次為cld2(cld3的60％)，cld1最弱(cld3的15％)。

36、與現有技術相比，本發明的優點及有益效果體現在以下方面：

37、本發明將去除轉運肽的cld1，cld2，cld3的n端融合上一個mbp標簽，然后通過在大腸桿菌中誘導表達并分別純化得到高純度蛋白(即mbp融合蛋白)。通過高效液相色譜法(hplc)發現，cld1，cld2，cld3都能水解葉綠素a和脫鎂葉綠素a，其中cld3還可以水解葉綠素b，進而產生脫植基葉綠素a/b，脫鎂葉綠酸a和植醇等有機物。cld3對所有三種底物的水解活性最高且可水解的酶種類最多。自然界中含有大量的葉綠素，但是其下游產物在生物界中含量較低，故直接獲取的效率較低；且這些水解產物有分子量較大或者較復雜的物質，所以從頭合成的難度和成本也較大。本發明提供的葉綠素水解酶(特別是cld3)可以高效降解葉綠素，產生大量的水解產物，來彌補當前工業和醫藥行業生產所需，彌補現有技術的不足，因此具有廣泛的應用前景。