專利名稱：一株腸膜明串珠菌及其胞外多糖與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株新的腸膜明串珠菌菌株及其胞外多糖，以及該胞外多糖的制備方法和應用。
背景技術：
微生物胞外多糖是指某些特定微生物(如乳酸菌、土壤桿菌、根瘤菌等)在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的一類糖類化合物，其中，依附于微生物細胞壁外的多糖被稱為莢膜多糖，而粘液多糖則以滲透于生長環境中的形式存在。微生物胞外多糖不但可以賦予發酵乳制品特殊的風味，還具有一定的降血脂、免疫調節和抗腫瘤等保健功能。更重要的是，隨著生活質量的不斷提高，與我們每個人日常生 活息息相關的一些食品添加劑(如增稠劑、乳化劑、穩定劑等)的食品安全問題越來越受到消費者的重視，因此，尋找來源明確、產量穩定、功能多樣的新型食品添加劑越來越受到研究者的重視。

發明內容
本發明的目的是提供一株新的腸膜明串珠菌菌株和由該菌株所產生的胞外多糖，以及該胞外多糖的制備方法和應用。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的。本發明提供的技術方案之一是一株腸膜明串珠菌菌株，其是保藏號為CGMCCNO. 6432 的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株。該菌株經16S rRNA基因測序的結果如SEQ ID NO.1所示。本發明提供的技術方案之二是一種腸膜明串珠菌的胞外多糖，所述的胞外多糖為葡聚糖，該胞外多糖的平均重量分子量在974 5230kDa之間。本發明中，所述的胞外多糖為一種純白色的絲狀物或粉末；5. Omg/mL的所述胞外多糖水溶液澄清透明、無色、無味，pH值為6. O 7.1。本發明中，所述的胞外多糖可以由前述保藏號為CGMCC NO. 6432的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株產生,也可以由其它的可以產胞外多糖的腸膜明串珠菌菌株產生。較佳地，所述的胞外多糖由前述保藏號為CGMCC NO. 6432的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株所產生。本發明提供的技術方案之三是一種如前所述的腸膜明串珠菌的胞外多糖的制備方法。本發明中，所述的制備方法可以是將所述的腸膜明串珠菌按照現有技術內常規的培養方法培養得到發酵液，然后將發酵液采用常規的多糖分離方法分離得到胞外多糖。較佳地，所述的制備方法包括如下步驟(I)將腸膜明串珠菌的種子液以體積比O. 5 4. 0%(ν/ν)的接種量接種于無菌培養基，于25 34°C培養24 120h得發酵液；其中，所述的無菌培養基為含有質量比為
6.O 12. 0%(w/w)脫脂乳粉和質量體積比為2. 5 10. 0%(w/v)蔗糖的脫脂乳蔗糖溶液，并在95 135°C下滅菌20 30min制成；(2)將步驟(I)所得的發酵液在95 100°C加熱10 30min，冷卻至15 25°C后，調節pH至4. 4 4. 8，靜置3 5h，離心取上清，加入2 4倍體積的80 100%乙醇于離心后的上清液中，靜置4 24h，離心收集沉淀物并將沉淀物溶于水，得沉淀物的水溶液；(3)將步驟(2)所得的沉淀物水溶液干燥后即得胞外多糖粗品。本發明中，所述的胞外多糖粗品包括85 95%的前述腸膜明串珠菌胞外多糖和5 15%的游離蛋白，所述的百分比為質量百分比。本發明中，較佳地，步驟(I)所述的腸膜明串珠菌的種子液為前述保藏號為CGMCCNO. 6432的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株的種子液。
本發明步驟(I)所述的無菌培養基打破了常規純化學培養基發酵明串珠菌的局限性，創新性地運用脫脂乳蔗糖溶液作為明串珠菌的發酵基料，在降低物料成本的同時，令發酵條件更簡單可行。與傳統的純化學培養基相比，天然來源的培養基料經明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)發酵而獲得的胞外多糖更具食品安全保障性,而且,使用脫脂乳鹿糖溶液培養明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)獲得的發酵液中胞外多糖的產量顯著提高。本發明中，步驟(2)較佳地為將步驟(I)所得的發酵液在95 100°C加熱10 30min,冷卻至室溫后,用鹽酸或食品級的乳酸調節pH至4. 6,靜置4h,9000rpm離心IOmin,取上清，加入2 4倍(v/v)的80 100%乙醇于上述離心后的上清液中，靜置過夜，9000rpm離心lOmin，收集沉淀物并溶于蒸餾水，得沉淀物的水溶液。本發明中，步驟(3 )所述干燥的方式為本領域常規，可以直接進行冷凍干燥或者在溫度不超過115°C下干燥或者真空冷凍干燥。本發明中，較佳地，在步驟(3)之后還包括步驟(4):將制得的胞外多糖粗品進行進一步的純化，以去除蛋白和雜質。本發明中，步驟(4)所述進一步的純化可以是現有技術中的任何常規的分離純化的步驟。較佳地，步驟(4)所述進一步的純化是采用三氯乙酸法去除蛋白和采用透析法去除其它雜質。所述的三氯乙酸法為將胞外多糖粗品用50 80°C蒸餾水溶解，使胞外多糖粗品的終濃度為0. 5 1. 0%，待溶液冷卻至20 25°C時加入三氯乙酸，使三氯乙酸的最終質量濃度為2 4%(w/v)，再將溶液于2 8°C靜置8 16h，離心或過濾去除沉淀物。所述的透析法為將去除沉淀后的胞外多糖溶液用截留分子量為10000道爾頓的透析膜在2 8°C透析48 60h ;在透析過程中較佳地還可以進行多次換水。更佳地，步驟(4)還包括，經過透析后的多糖溶液還可以采用凝膠排阻層析的方法進行更進一步的純化。本發明中，較佳地，步驟(4)所述進一步的純化后的多糖溶液可進行干燥以獲得粉末狀的腸膜明串珠菌胞外多糖，干燥方法可以為本領域常規，較佳地選自熱風干燥、低溫干燥、冷風干燥、冷凍干燥、真空干燥和真空冷凍干燥中的任一種，更佳的干燥方法選自冷風干燥、冷凍干燥、真空干燥和真空冷凍干燥中的任一種。本發明提供的技術方案之四是一種增稠組合物，其包括前述胞外多糖和生理學上可接受的載體。本發明中，所述的生理學上可接受的載體為常規，可以是食品領域常規的增稠劑輔料，如食品膠、淀粉等，也可以是其他領域符合國家相應標準的增稠劑輔料。本發明提供的技術方案之五是前述胞外多糖或增稠組合物在食品、制藥和相關領域的應用。本發明中，由于腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)胞外多糖或多糖粗品能很好的溶于水形成膠態水溶性聚合物，能在低濃度時具有很高的粘度、很好的表面活性、很好的蛋白質可混性以及極好的穩定性/乳化性。基于這些性質，本發明所述胞外多糖或胞外多糖粗品可以被用作增稠劑、穩定劑、懸浮劑、乳化劑或潤滑劑及其相關用途。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。本發明所用試劑和原料均市售可得。本發明的積極進步效果在于本發明所述腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株的胞外多糖水溶性好，且在低濃度時具有很好的粘度、彳艮好的表面活性、很好的蛋白質可混性以及極好的穩定性/乳化性。本發明的制備方法獲得的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)胞外多糖或多糖粗品產量高，食品安全性強，其可以作為添加劑應用于食品、制藥和相關領域中，應用前景十分廣闊。牛物材料保藏信息本發明提供的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株，已于2012年8月13日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，郵編100101。該菌株的保藏編號為CGMCC No. 6432。


以下結合

本發明的特征和有益效果。圖1顯示28°C、180rpm的好氧條件下,不同接種量對腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides) Leuco4胞外多糖粗品產量的影響；圖2顯示28 °C、180rpm的好氧條件下，不同脫脂乳濃度對(Leuconostocmesenteroides) Leuco4胞外多糖粗品產量的影響；圖3顯示28 °C、180rpm的好氧條件下，不同鹿糖濃度對(Leuconostocmesenteroides) Leuco4胞外多糖粗品產量的影響；圖4顯不I8Orpm的好氧條件下，不同發酵溫度對(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖粗品產量的影響；圖5顯不最適條件下腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) Leuco4在脫脂乳蔗糖培養基和純化學培養基中的產胞外多糖能力的比較；圖6顯不腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) Leuco4胞外多糖(純品)糖基組成的色譜分析結果。
具體實施方式
下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。本發明中所述的室溫是指進行試驗的操作間的溫度，一般為25°C。實施例1菌株的獲得本發明中的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株通過如下途徑獲得以無菌藥勺取云南來源的泡菜I克，并用無菌生理鹽水系列稀釋，通過涂布的方式將稀釋液均勻涂布于無菌的M17蔗糖瓊脂培養基(以5%(w/v)蔗糖取代M17培養基中O. 5%(w/V)的乳糖，OXOID LTD.，英國)上，28°C培養24小時，選取拉絲性好，菌落光滑有明顯突起的菌落，轉接到蔗糖M17蔗糖液體培養基中，于28°C、180rpm搖床培養48h，將發酵液在100°C加熱20min，冷卻至20°C后，用食品級的乳酸或鹽酸調節pH至4. 60，靜置4h，9000rpm離心IOmin,取上清，加入3倍(v/v)的95%乙醇于上述離心后的上清液中，靜置過夜，9000rpm離心lOmin，收集沉淀物并溶于蒸餾水，將該沉淀物水溶液直接冷凍干燥即得胞外多糖粗品，通過苯酚硫酸法對不同菌株的胞外多糖粗品中多糖的含量進行測定，篩選出一株高產胞外多糖的菌株BD01710。 該菌株經16S rRNA基因測序的結果如SEQ ID NO.1所示。根據其生理生化特性及16S rRNA序列分析的結果，經中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)鑒定為(Leuconostoc mesenteroides)菌種，并將其命名為(Leuconostoc mesenteroides)Leuco40該菌株已于2012年08月13日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101o該菌株的保藏編號為CGMCC NO. 6432。該菌株的微生物學特性如表I所示表I (Leuconostoc mesenteroides) Leuco4 菌株理化試驗結果
權利要求
1.一株腸膜明串珠菌菌株，其特征在于，其是保藏號為CGMCC NO. 6432的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株。
2.一種腸膜明串珠菌的胞外多糖，其特征在于，所述的胞外多糖為葡聚糖，其為一種純白色的絲狀物或粉末；該胞外多糖的平均重量分子量在974 5230kDa之間。
3.如權利要求2所述的胞外多糖，其特征在于，5.Omg/mL的所述胞外多糖水溶液澄清透明、無色、無味，pH值為6. O 7.1。
4.如權利要求2所述的胞外多糖，其特征在于，所述的胞外多糖由保藏號為CGMCC NO. 6432 的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株產生。
5.一種如權利要求2 4任一項所述的腸膜明串珠菌的胞外多糖的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括如下步驟(O將腸膜明串珠菌的種子液以體積比O. 5 4. 0%的接種量接種于無菌培養基，于 25 34°C培養24 120h得發酵液；其中，所述的無菌培養基為含有質量比為6. O 12. 0% 脫脂乳粉和質量體積比為2. 5 10. 0%蔗糖的脫脂乳蔗糖溶液，并在95 135°C下滅菌 20 30min制成；(2)將步驟(I)所得的發酵液在95 100°C加熱10 30min，冷卻至15 25°C后，調節 pH至4. 4 4. 8，靜置3 5h，離心取上清，加入2 4倍體積的80 100%乙醇于離心后的上清液中，靜置4 24h，離心收集沉淀物并將沉淀物溶于水，得沉淀物的水溶液；(3)將步驟(2)所得的沉淀物水溶液干燥后即得胞外多糖粗品。
6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的胞外多糖粗品包括85 95%如權利要求2所述的腸膜明串珠菌的胞外多糖和5 15%的游離蛋白，所述的百分比為質量百分比。
7.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述的腸膜明串珠菌的種子液是保藏號為CGMCC NO. 6432的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的種子液；步驟(2)所述離心的條件為9000rpm、lOmin。
8.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，在步驟(3)之后還包括步驟(4):將制得的胞外多糖粗品進行進一步的純化，以去除蛋白和雜質。
9.一種增稠組合物，其特征在于，所述增稠組合物包括如權利要求2所述的腸膜明串珠菌的胞外多糖和生理學上可接受的載體。
10.如權利要求2所述的腸膜明串珠菌的胞外多糖或如權利要求9所述的增稠組合物在食品、制藥和相關領域的應用。
全文摘要
本發明公開了一株腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株和該菌株的胞外多糖以及該胞外多糖的制備方法，還公開了一種增稠組合物及前述胞外多糖或前述增稠組合物在食品、制藥和相關領域的應用。該腸膜明串珠菌菌株的保藏號為CGMCC NO.6432；該胞外多糖為葡聚糖，其平均重量分子量在974～5230kDa之間；所述增稠組合物包括前述腸膜明串珠菌的胞外多糖和生理學上可接受的載體。本發明所述的胞外多糖水溶性好，且在低濃度時具有很好的粘度、很好的表面活性、很好的蛋白質可混性及極好的穩定性/乳化性；本發明的制備方法獲得的胞外多糖或粗品產量高，應用前景十分廣闊。
文檔編號C08B37/02GK103013891SQ201210581248
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者韓瑨, 吳正鈞, 周方方, 季紅, 游春蘋, 郭本恒, 艾連中 申請人:光明乳業股份有限公司