本發(fā)明屬于醫(yī)藥和化妝品，尤其是一種具有生發(fā)作用的生物素三肽及其組合物、制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、全球范圍內(nèi)，脫發(fā)問題日益嚴(yán)重。2021年國家衛(wèi)建委發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，中國脫發(fā)人數(shù)已超2.5億，其中男性占較高比例（65%），女性占比35%。此外，在當(dāng)前快節(jié)奏生活和高壓環(huán)境下，脫發(fā)人群呈現(xiàn)年輕化趨勢。我國“80后”和“90后”人群的脫發(fā)比例越來越高，分別占總脫發(fā)人群的37.9%和39.3%。《2024年中國毛發(fā)健康服務(wù)行業(yè)研究》數(shù)據(jù)表明，2028年毛發(fā)健康市場將超過千億元。

2、目前，應(yīng)對脫發(fā)的主要手段包括藥物治療、植發(fā)手術(shù)、防脫生發(fā)化妝品等。臨床上應(yīng)用的治療脫發(fā)的藥物只有兩種：口服藥物非那雄胺和外用藥物米諾地爾。然而近年來有報道表明，二者在患者使用過程中均存在明顯的不良反應(yīng)，外用米諾地爾具有脫發(fā)、過敏性皮炎、紅斑、瘙癢、頭皮屑、也可能有水腫、頭暈、心率加快等不良反應(yīng)，口服非那雄胺的不良反應(yīng)包括性欲降低，勃起功能障礙，射精量減少，睪丸疼痛，抑郁和男性乳房發(fā)育等。植發(fā)手術(shù)指將后枕部等健康的毛囊移植到脫發(fā)區(qū)域，其效果相對持久，但需要選擇正規(guī)醫(yī)療機構(gòu)，且治療費用較高，長期需要藥物維持等問題。因此，尋找高效、安全的防脫生發(fā)類藥物或化妝品具有重要的研究意義與實際應(yīng)用價值。

3、生物素三肽-1是由生物素（維生素b7）與三肽（甘氨酸、組氨酸、賴氨酸）通過酰胺鍵連接而成，序列為生物素ghk。這種結(jié)構(gòu)使其既具備生物素的營養(yǎng)功效，又增加了其在皮膚和毛發(fā)中的生物活性。生物素三肽-1能夠增加膠原蛋白iv和層粘連蛋白5合成，為毛囊提供支撐并維持皮膚和毛囊連接，從而將頭發(fā)牢固地固定在真皮毛囊內(nèi)，有助于預(yù)防脫發(fā)；同時，它能夠激活血管內(nèi)皮生長因子（vascular?endothelial?growth?factor，vegf）和角質(zhì)細(xì)胞生長因子（keratinocyte?growth?factor，kgf）等組織修復(fù)相關(guān)基因，促進(jìn)毛囊周圍血管生成和細(xì)胞增殖，以促進(jìn)毛囊營養(yǎng)供應(yīng)，從而發(fā)揮生發(fā)作用；此外，其能減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，抑制自由基生成，減少炎癥因子表達(dá)，延長毛囊生長周期。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明對生物素三肽-1進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，將氨基酸替換為其他氨基酸，并對其生發(fā)活性進(jìn)行測試，實驗結(jié)果表明，該樣品表現(xiàn)出良好的生發(fā)活性，有著較好的應(yīng)用前景。

4、此外，目前用于化妝品中添加的生發(fā)類原料還有銅肽（ghk-cu）、乙?；碾?3、肉豆蔻酰五肽-4、乙?；?8、棕櫚酰三肽-8等。其中，銅肽需依賴納米載體或促滲劑輔助吸收，且成本較高；肉豆蔻酰五肽-4和乙?；?8分子量較大，難以透膜到達(dá)毛囊深層（毛乳頭區(qū)域）；棕櫚酰三肽-8可緩解神經(jīng)炎癥，但對雄性激素脫發(fā)引起的脫發(fā)無直接抑制作用；乙?；碾?3在含醇體系中容易沉淀，在高濃度乙醇中不穩(wěn)定。現(xiàn)有技術(shù)中，生發(fā)類藥物具有明顯副作用，生發(fā)類化妝品原料雖然副作用小，但也存在透皮吸收效率低、穩(wěn)定性差、作用機制單一、成本高昂等不足，因此，研發(fā)新型小分子生發(fā)多肽具有重要的研究意義和市場需求。而本發(fā)明中生物素三肽，具有肽鏈短分子量相對較小的特點，易于透膜吸收，乙?；蟾淄高^細(xì)胞膜，到達(dá)毛囊深層；連接生物素后，具備生物素三肽-1的特點，但生發(fā)活性卻高于生物素三肽-1；經(jīng)過轉(zhuǎn)鹽工藝，可獲得醋酸鹽，比三氟乙酰鹽的生物相容性更加優(yōu)良；此外，本發(fā)明中生物素三肽連接生物素或進(jìn)行組合使用，可避免作用機制單一性的問題。

5、通過檢索，發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明專利申請相關(guān)的公開文獻(xiàn)：

6、1、期刊雜志：efficacy?and?safety?of?a?new?topical?hair?loss-lotioncontaining?oleanolic?acid,?apigenin,?biotinyl?tripeptide-1,?diaminopyrimidineoxide,?adenosine,?biotin?and?ginkgo?biloba?in?patients?with?androgeneticalopecia?and?telogen?effluvium:?a?six-month?open-label?prospective?clinicalstudy[j].?journal?of?cosmetology&trichology,?2018,?4(1):?1-6.?garre等人使用含有生物素三肽-1的多成分洗劑進(jìn)行實驗，研究發(fā)現(xiàn)其能顯著增加毛囊總數(shù)和生長期的毛囊數(shù)量，但未單獨研究生物素三肽-1對毛發(fā)生長的活性作用。該文獻(xiàn)也沒有關(guān)于衍生物結(jié)構(gòu)和活性的報道。

7、2、中國專利：丁文峰，一種用于毛發(fā)生長的多肽組合物，公開號cn105106028a，公開日期2015年12月2日。該專利公開了一種包含促進(jìn)膠原蛋白生成和促進(jìn)角質(zhì)蛋白生成的多肽組合物，可以促進(jìn)毛發(fā)生長、增長、變得更加濃密。該組合物與本發(fā)明有著本質(zhì)的不同，上述專利組合物中多肽全部為已經(jīng)報道的具有生發(fā)效果的多肽，而本發(fā)明中專利并非化妝品目錄中多肽，而是本課題組合成的且首次發(fā)現(xiàn)具有生發(fā)活性的多肽。

8、3、中國專利：平川洋平，等。促進(jìn)毛發(fā)生長的寡肽，公開號cn1445236a，公開日期2003年10月1日。該專利公開了5-15個或7-100個氨基酸的寡肽的及其促進(jìn)毛發(fā)生長的活性。上述專利與本發(fā)明不同之處，一是上述專利并沒有公開帶生物素的多肽序列，而本發(fā)明中多肽為生物素三肽，并不在保護(hù)范圍內(nèi)；二是上述發(fā)明公開的是5-15個或7-100個氨基酸的寡肽，而本發(fā)明中多肽為生物素三肽。

9、4、中國專利：姚燕容。一種防脫生發(fā)組合物及其制備方法和應(yīng)用，申請?zhí)朿n115444918a，公開日期2022年12月9日。該專利公開了一種中藥組合物，并沒有多肽成分。與本發(fā)明有本質(zhì)的不同。

10、通過對比，本發(fā)明與上述公開文獻(xiàn)存在本質(zhì)的不同，首先，本發(fā)明通過將生物素三肽-1進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，獲得了一系列新型生物素三肽，并將這些肽進(jìn)行組合獲得組合物，實驗結(jié)果表明，所有獲得的生物素三肽單體及其組合物具有良好的生發(fā)活性。因此，獲得新型具有生發(fā)活性的生物素三肽-1的衍生物及其組合物，且衍生物及其組合物的生發(fā)活性優(yōu)于生物素三肽-1，是本發(fā)明技術(shù)方案的動機。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種具有生發(fā)作用的生物素三肽及其組合物、制備方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

3、一種具有生發(fā)作用的生物素三肽及其組合物，所述生物素三肽及其組合物，結(jié)構(gòu)通式如下：

4、，其中，aa為氨基酸。

5、進(jìn)一步地，所述氨基酸為酪氨酸y、天冬氨酸d和精氨酸r，生物素三肽名稱分別依次對應(yīng)為生物素yhk、生物素dhk、生物素rhk；所述組合物為生物素yhk、生物素dhk、生物素rhk中任意兩者組合，或者三者組合，或者兩者組合和三者組合后再添加化妝品中其他生發(fā)多肽的組合。

6、進(jìn)一步地，各多肽組分的質(zhì)量濃度為0.000001%~5%。

7、進(jìn)一步地，所述生物素三肽及其組合物還包括游離生物素三肽，或其藥學(xué)或化妝品中可接受的鹽、?；a(chǎn)物，生物素三肽及其組合物為三氟乙酸鹽、乙酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、棕櫚酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽；或其藥學(xué)或化妝品中可接受的酰化產(chǎn)物為上述生物素三肽的乙?；?、丙?；⑷廪Ⅴ；?，棕櫚?；?、月桂?；a(chǎn)物。

8、如上所述的生物素三肽及其組合物的制備方法，包括如下步驟：

9、s1-1、固相合成樹脂預(yù)處理：二氯樹脂真空干燥后，每1g二氯樹脂中加入1-50?ml無水n,?n-二甲基甲酰胺dmf活化；

10、s1-2、樹脂連接賴氨酸k或n-酰化賴氨酸：每1g上述活化后的樹脂中加入1-10摩爾的帶保護(hù)基的賴氨酸、1-50ml的dmf、1-50ml的n，n-二異丙基乙胺dipea，室溫震蕩反應(yīng)1-10h，抽濾棄去反應(yīng)液；加入0.1-10?ml甲醇，反應(yīng)10?min-4?h；抽濾收集固體，向管中加入1-50ml的dmf，震蕩洗滌，棄去溶劑；向管中加入1-50?ml異丙醇，震蕩洗滌，棄去溶劑；向管中再加入1-50?ml的dmf，震蕩洗滌，抽濾，收集固體；

11、s1-3、賴氨酸脫保護(hù)：以樹脂質(zhì)量每1g計，s1-2獲得的固體，加入1-50?ml脫保護(hù)基溶劑進(jìn)行脫保護(hù)，室溫震蕩反應(yīng)10?min-4?h，抽濾，重復(fù)以上步驟2次，抽濾得固體；檢測脫保護(hù)的完成后，向管中加入1-50?ml的dmf，震蕩洗滌，棄去溶劑；向管中加入1-50?ml異丙醇，震蕩洗滌，棄去溶劑；向管中再加入1-50?ml的dmf，震蕩洗滌，抽濾，收集固體；

12、s1-4、連接組氨酸h：以樹脂質(zhì)量每1g計，s1-3獲得的固體，加入1-10摩爾的帶保護(hù)基的組氨酸、1-5摩爾的苯并三氮唑-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸鹽即hbtu、0.1-5摩爾比的1-羥基苯并三唑即hobt、1-50ml的dmf、1-50ml的dipea，室溫震蕩反應(yīng)1-10?h，抽濾棄去反應(yīng)液；加入0.1-10?ml的甲醇，反應(yīng)10?min-4?h；抽濾收集固體，向管中加入1-50ml的dmf，震蕩洗滌，棄去溶劑；向管中加入1-50ml的異丙醇，震蕩洗滌，棄去溶劑；向管中再加入1-50ml的dmf，震蕩洗滌，抽濾，收集固體；

13、s1-5、組氨酸脫保護(hù)：原料為s1-4固體，脫保護(hù)基的溶劑與s1-3步驟相同，后處理方式也與s1-3步驟相同；

14、s1-6、連接酪氨酸y或者天冬氨酸d或者連接精氨酸r：以樹脂質(zhì)量每1g計，s1-5獲得的固體，加入1-10摩爾的帶保護(hù)基的酪氨酸或者天冬氨酸或者精氨酸、1-5摩爾的hbtu、0.1-5摩爾的hobt、1-50ml的dmf、1-50ml的dipea，室溫震蕩反應(yīng)1-10?h，抽濾棄去反應(yīng)液；加入0.1-10ml的甲醇，反應(yīng)10?min-4?h；抽濾收集固體，向管中加入1-50ml的dmf，震蕩洗滌，棄去溶劑；向管中加入1-50ml異丙醇，震蕩洗滌，棄去溶劑；向管中再加入1-50ml的dmf，震蕩洗滌，抽濾，收集固體；

15、s1-7、脫保護(hù)：步驟與s1-3相同；原料為s1-6固體，脫保護(hù)基的溶劑與s1-3步驟相同，后處理方式也與s1-3步驟相同；

16、s1-8、連接生物素：以樹脂質(zhì)量每1g計，s1-7獲得的固體，加入1-10摩爾的生物素、1-10摩爾的hbtu、0.1-5摩爾的hobt、1-50ml的dmf、1-50ml的dipea，室溫震蕩反應(yīng)1-10?h，抽濾收集固體，向管中加入1-50ml的dmf，震蕩洗滌，棄去溶劑；向管中加入1-50ml的異丙醇，震蕩洗滌，棄去溶劑；向管中再加入1-50ml的dmf，震蕩洗滌，抽濾，收集固體；

17、s1-9、固相樹脂裂解：每1?g的s1-8制得的固體加入1-50?ml裂解液，室溫攪拌2-8h；反應(yīng)完畢后，抽濾，收集上清液，把上清液倒入預(yù)冷的2-20倍體積的乙醚中，0℃放置5-24h，析出固體，離心2-25?min，轉(zhuǎn)速1000-20000?rpm，收集沉淀，乙醚洗滌2次，固體干燥，得到產(chǎn)物生物素yhk三氟乙酸鹽、生物素dhk三氟乙酸鹽和生物素rhk三氟乙酸鹽，或?；纳锼貀hk三氟乙酸鹽、生物素dhk三氟乙酸鹽和生物素rhk三氟乙酸鹽；

18、s1-10、轉(zhuǎn)鹽與純化

19、利用中壓制備色譜與c-18色譜柱，將三氟乙酸轉(zhuǎn)化為醋酸鹽并進(jìn)行純化，具體條件如下：色譜條件：流速1-100?ml/min，檢測波長220-360?nm；流動相：a1：5-1000?mmol醋酸銨水溶液、a2：含有質(zhì)量濃度為0.01%-1%醋酸的水溶液、b1：含有質(zhì)量濃度為0.01%-1%醋酸的甲醇溶液；梯度洗脫條件：95%?a1和5%?b1，5-40?min，95%~5%?a1和5%~95%?b1，10-60min；上述方法可以獲得生物素yhk醋酸鹽、生物素dhk醋酸鹽和生物素rhk醋酸鹽，或者酰化的生物素yhk醋酸鹽、生物素dhk醋酸鹽和生物素rhk醋酸鹽純品，即得到具有生發(fā)作用的生物素三肽及其組合物。

20、進(jìn)一步地，所述s1-2中帶保護(hù)基的賴氨酸為fmoc-lys(boc)-oh或者n-叔丁氧羰基-n’-乙酰-賴氨酸即boc-lys(ac)-oh；

21、或者，所述s1-3中?脫保護(hù)基溶劑為嗎啡啉：dmf的體積比為1:9~5:5的嗎啡啉和dmf的混合物。

22、進(jìn)一步地，所述s1-4中帶保護(hù)基的組氨酸為fmoc-his(trt)-oh；

23、或者，所述s1-6中帶保護(hù)基的酪氨酸為fmoc-try(tbu)-oh，天冬氨酸為fmoc-asp(otbu)-oh，精氨酸為fmoc-arg(pbf)-oh。

24、進(jìn)一步地，所述s1-9中裂解液為苯酚：乙二硫醇：苯甲硫醚：水：三氟乙酸的體積比為1～10：1～10：1～10：1～10：60～96的苯酚、乙二硫醇、苯甲硫醚、水、三氟乙酸的混合物。

25、如上所述的生物素三肽及其組合物在制備生發(fā)類藥物方面的應(yīng)用。

26、如上所述的生物素三肽及其組合物在制備生發(fā)類化妝品方面的應(yīng)用。

27、本發(fā)明取得的優(yōu)點和積極效果為：

28、1、本發(fā)明的新型生物素三肽及其組合物具有較好的生發(fā)活性，能夠促進(jìn)毛發(fā)生長、增長，變得更加濃密，能夠調(diào)控毛囊的生長周期，增加毛發(fā)的生長速度，增加毛發(fā)發(fā)量。本發(fā)明的生物素三肽及其組合物可以用于藥品和/或化妝品。因此，該類化合物具有良好的應(yīng)用前景。

29、2、固相合成方法所制備的多肽多為三氟乙酸鹽，對毛囊的刺激作用較大。而本發(fā)明結(jié)合中壓制備液相的技術(shù)，將三氟乙酸鹽型多肽轉(zhuǎn)變?yōu)榇姿猁}，醋酸鹽生物相容性好，對毛囊的刺激性小。

30、3、本發(fā)明生物素三肽及其組合物的安全性較高。本發(fā)明的生物素三肽及其組合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)相對簡單，免疫原性較低，引起人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的可能性較小，降低了過敏等不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險；且在體內(nèi)代謝過程中，多肽通常被分解為氨基酸等無害的小分子物質(zhì)，不會在體內(nèi)積累產(chǎn)生毒性。

31、4、本發(fā)明操作過程不需無水無氧操作，操作簡便，原料與試劑廉價易得，適合大規(guī)模生產(chǎn)和開發(fā)。

32、5、本發(fā)明中生物素三肽，具有肽鏈短分子量相對較小的特點，易于透膜吸收，乙?；蟾淄高^細(xì)胞膜，到達(dá)毛囊深層。

33、6、本發(fā)明中連接生物素后，具備生物素三肽-1的特點，但生發(fā)活性卻高于生物素三肽-1。