本發明屬于生物技術和醫學領域，具體涉及一種膽固醇羥化酶ch25h干預多肽在制備骨質疏松癥和骨溶解癥治療產品中的應用。

背景技術：

1、衰老是一個復雜、多階段、漸進的過程，發生在生命的整個過程。衰老的主要特點之一是全身慢性炎癥，并伴有細胞衰老、免疫衰老、器官功能障礙和各種年齡相關疾病[1]。隨著年齡增加，與衰老相關的疾病，尤其是骨骼退行性疾病如骨質疏松癥(osteoporosis，op)和骨溶解(osteolysis，ol)的發病率不斷增加。在高齡人群或絕經后婦女骨骼系統中，破骨細胞(osteoclast，oc)功能亢進，當oc介導的骨吸收超過成骨細胞介導的骨生成時，骨代謝失衡導致op[2-3]。此外，人工植入的假體周圍磨損顆粒誘導oc增殖分化引起ol，oc過度增殖分化與功能亢進是導致人工關節無菌性松動的主要原因[4]。目前，慢性炎癥已被認為是衰老的內源性因素，而oc的活化受到多種炎癥因子調節，針對oc分化與功能調控的基礎研究，尤其是負向調控信號通路的研究及藥物作用靶點的開發，可為有效防治衰老相關疾病op和ol提供新靶點和新策略。

2、oc生成的過程受到各種細胞及炎癥因子如rankl(receptor?activator?ofnuclear?factor-κb?ligand，核因子κb受體激活因子配體)、tnf-α(tumor?necrosisfactor-α，腫瘤壞死因子α)和il-1(interleukin-1，白細胞介素-1)的調節，上述因子均能夠誘導nf-κb(nuclear?factor-κb，核因子κb)活化，nf-κb對于生理和病理條件下的oc形成和存活至關重要[5]。nf-κb在oc生理學中的核心作用主要包括rankl、rank和traf6，其中traf6已被證明通過iκb激酶(ikk)激活轉錄因子nf-κb，并通過mapk(mitogen-activatedprotein?kinase，絲裂原活化蛋白激酶)、erk((extracellular?signal-regulatedkinase，胞外信號調節激酶)、jnk(c-jun?nh2-terminal?kinase，c-jun氨基末端激酶)來激活ap-1(activator?protein-1，激活蛋白-1)[6]。此外，traf6-c末端缺失與截短rank(receptor?activator?for?nuclear?factor-κ，核因子κb受體活化因子)受體保留了其刺激jnk活性而非nf-κb活性的能力，表明rank與traf6的相互作用是nf-κb活化所必需的[7]。traf6在維持正常骨結構中的重要性已在traf6敲除小鼠中得到證實，該小鼠顯示出nf-κb信號傳導缺陷，因此發生骨硬化癥[8]。研究表明traf6可作為泛素連接酶的功能阻斷k63多聚泛素鏈合成，從而阻止traf6激活ikk[9]。因此，通過靶向traf6從而有效抑制nf-κb介導的炎癥是治療衰老與炎癥相關的骨骼退行性相關疾病的潛在途徑。

3、膽固醇-25-羥化酶(cholesterol?25-hydroxylase，ch25h)涉及膽固醇的生物合成途徑和細胞膜特性，并在調節膽固醇穩態、炎癥和免疫反應中發揮多重作用[10]。ch25h在抗病毒免疫中也發揮重要作用，可在病毒進入過程中限制病毒與細胞膜的融合，并廣泛抑制vsv(vesicular?stomatitis?virus，水泡性口炎病毒)、hiv-1(human?immunodeficiencyvirus?type?1，人類免疫缺陷病毒1型)、zikv(zika?virus，寨卡病毒)、mers-cov(middleeast?respiratory?syndrome?coronavirus，中東呼吸綜合征冠狀病毒)和sars-cov-2(severe?acute?respiratory?syndrome?coronavirus?2，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2)等病毒感染[11]。ch25h在腫瘤免疫治療領域的作用日趨體現，ch25h通過膽固醇代謝重編程調控腫瘤相關巨噬細胞，ch25h作為藥物干預靶點在腫瘤治療中具有巨大潛力[12]。此外，相關研究表明在軟骨細胞中膽固醇代謝的ch25h-cyp7b1-rorα軸(膽固醇25-羥化酶-細胞色素p450?7b1-視黃醇相關孤兒受體α軸)參與調控骨關節炎，ch25h在骨關節炎的發病機制中發揮重要作用，但ch25h能否通過酶活非依賴的方式調控oc分化和功能及分子調控機制尚不清楚，需要進一步探索[13]。

4、對于衰老與慢性炎癥導致oc過度活化引起的op、ol等疾病還缺乏安全有效的治療藥物，本領域迫切需要開發靶向衰老及慢性炎癥防治op和ol的新途徑和新藥物。目前，針對治療op及ol的藥物研發已取得突破性進展，然而在安全性與有效性方面仍面臨挑戰。比如部分患者在中斷使用地諾單抗后，會遭遇骨量顯著下降及反彈性椎體骨折風險增加的問題。另一方面，唑來膦酸的應用有一定療效，但會誘發部分患者出現胃腸道不良反應。至于假體植入后的失敗與翻修情況，主要歸因于假體的松動、穩定性不足及磨損等因素，影響假體的使用壽命，還會加劇ol進程及骨量丟失。鑒于此，深入探究op及ol的生理病理機制，尋找更優的治療靶點，對于提升患者治療效果及生活質量具有深遠的臨床意義

5、ch25h在病毒感染、炎癥性疾病、骨關節炎、自身免疫性疾病和腫瘤等多種疾病中作為影響疾病進程的關鍵靶點發揮重要作用，其表達水平的變化可以通過信號傳導調控相關疾病的發生發展。比如專利文獻1中涉及了在體外細胞實驗中，ch25h能夠抑制sars-cov-2的感染，且安全性較好。比如專利文獻2中涉及了通過共表達ch25h增強car-t細胞抗腫瘤活性的方法，提供了包含car和ch25h的修飾的免疫細胞或其前體(例如，t細胞)。ch25h在相關疾病的進程中發揮重要作用，但是并未涉及ch25h通過酶活非依賴的方式調控oc分化從而參與op、ol等疾病中的作用機制及應用。同時，以ch25h為靶點設計干預多肽尚無報道。

6、引用文獻：

7、非專利文獻：

8、[1]campisi?j,kapahi?p,lithgow?gj,melov?s,newman?jc,verdin?e.fromdiscoveries?in?ageing?research?to?therapeutics?for?healthyageing.nature.2019jul；571(7764):183-192.

9、[2]teitelbaum?sl.bone?resorption?by?osteoclasts.science.2000sep?1；289(5484):1504-1508.

10、[3]walker?md,shane?e.postmenopausal?osteoporosis.n?engl?j?med.2023nov

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12、[4]gallo?j,goodman?sb,konttinen?yt,raska?m.particledisease:biologicmechanisms?of?periprosthetic?osteolysis?in?total?hip?arthroplasty.innateimmun.2013；19(2):213-224.

13、[5]guo?q,jin?y,chen?x,ye?x,shen?x,lin?m,zeng?c,zhou?t,zhang?j.nf-κbin?biology?and?targeted?therapy:new?insights?and?translationalimplications.signal?transduct?target?ther.2024mar4；9(1):53.

14、[6]xu?j,wu?hf,ang?es,yip?k,woloszyn?m,zheng?mh,tan?rx.nf-kappabmodulators?in?osteolytic?bone?diseases.cytokine?growth?factor?rev.2009feb；20(1):7-17.

15、[7]darnay?bg,haridas?v,ni?j,moore?pa,aggarwal?bb.characterization?ofthe?intracellular?domain?of?receptor?activator?of?nf-kappab(rank).interactionwith?tumor?necrosis?factor?receptor-associated?factors?and?activation?of?nf-kappab?and?c-jun?n-terminal?kinase.j?biol?chem.1998aug

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17、[8]li?s,shu?b,zhang?y,li?j,guo?j,wang?y,ren?f,xiao?g,chang?z,chend.carboxyl?terminus?of?hsp70-interacting?protein?regulation?of?osteoclastformation?in?mice?through?promotion?of?tumor?necrosis?factor?receptor-associated?factor?6protein?degradation.arthritis?rheumatol.2014jul；66(7):1854-1863.

18、[9]zhang?y,zhu?z,cao?y,xiong?z,duan?y,lin?j,zhang?x,jiang?m,liu?y,manw,jia?t,feng?j,chen?y,li?c,guo?b,sun?d.rnd3?suppresses?endothelial?cellpyroptosis?in?atherosclerosis?through?regulation?of?ubiquitination?oftraf6.clin?transl?med.2023sep；13(9):e1406.

19、[10]zhao?j,chen?j,li?m,chen?m,sun?c.multifaceted?functions?of?ch25hand?25hc?to?modulate?the?lipid?metabolism,immune?responses,and?broadlyantiviral?activities.viruses.2020jul?6；12(7):727.

20、[11]majdoul?s,compton?aa.lessons?in?self-defence:inhibition?of?virusentry?by?intrinsic?immunity.nat?rev?immunol.2022jun；22(6):339-352.

21、[12]xiao?j,wang?s,chen?l,ding?x,dang?y,han?m,zheng?y,shen?h,wu?s,wangm,yang?d,li?n,dong?c,hu?m,su?c,li?w,hui?l,ye?y,tang?h,wei?b,wang?h.25-hydroxycholesterol?regulates?lysosome?amp?kinase?activation?and?metabolicreprogramming?to?educate?immunosuppressive?macrophages.immunity.2024may?14；57(5):1087-1104.

22、[13]choi?ws,lee?g,song?wh,koh?jt,yang?j,kwak?js,kim?he,kim?sk,son?yo,nam?h,jin?i,park?zy,kim?j,park?iy,hong?ji,kim?ha,chun?ch,ryu?jh,chun?js.thech25h-cyp7b1-rorαaxis?of?cholesterol?metabolism?regulatesosteoarthritis.nature.2019feb；566(7743):254-258.

23、專利文獻：

24、專利文獻1：《膽固醇-25-羥化酶及其酶促產物在制備抑制新型冠狀病毒的藥物中的用途》，公開號cn113018421b；

25、專利文獻2：《methods?for?enhancing?the?anti-tumor?activity?of?car?tcells?by?co-expression?of?ch25h》，公開號wo2024036167a3。

技術實現思路

1、發明要解決的問題

2、本技術屬于生物技術和醫學領域。本發明的目的在于提供一種防治oc過度活化所致骨破壞疾病的新途徑，即以ch25h作為靶點設計干預多肽(含有16aa的traf6多肽片段)，與traf6競爭結合ch25h，從而破壞ch25h對traf6的穩定作用，達到防治op和ol的效果。所述oc是執行骨吸收的主要功能細胞，在骨發育、生長、修復與重建中具有重要作用。oc過度活化，骨吸收功能增強，會引起op、ol等疾病。具體而言，本技術涉及ch25h干預多肽在op、ol中的防治效果、作用機制、實施方法和用途。

3、用于解決問題的方案

4、本發明研究了ch25h缺失在oc分化和op、ol等疾病中的作用機理及應用。首先，比較年輕與老齡小鼠組織中ch25h的表達情況及op病人ch25h的表達情況，相關結果表明老齡小鼠高表達ch25h，此外geo數據庫分析發現op病人ch25h表達上調。然后體外通過提取原代巨噬細胞bmms評估ch25h缺失對oc分化與功能的影響，相關結果表明ch25h缺失能夠抑制oc分化。此外在體內通過構建小鼠去卵巢誘導op模型和鈦顆粒誘導ol模型，觀察ch25h缺失對去卵巢誘導op和鈦顆粒誘導ol模型的治療作用，分析各項指標，相關結果表明體內ch25h缺失能夠緩解去卵巢誘導op模型和鈦顆粒誘導ol模型的骨丟失癥狀。接下來進行相關分子機制探索，初步探討ch25h缺失通過酶活非依賴方式減少ch25h-traf6軸介導的炎癥從而抑制oc分化。在保證ch25h干預多肽的安全性前提下，與traf6競爭結合ch25h，減少ch25h對traf6的穩定作用，加速traf6降解，從而抑制oc分化與功能，這證明靶向ch25h的干預多肽有預防和/或治療op以及ol等疾病的潛力。

5、本發明的技術方案如下：

6、[1].干預多肽在制備預防和/或治療破骨細胞過度活化及相關病癥的產品中的用途，其特征在于，所述干預多肽包含競爭性結合ch25h蛋白的位點；

7、所述競爭性結合ch25h蛋白的位點如seq?id?no.1的第430～432位所示；

8、所述干預多肽包含不少于15個氨基酸殘基。

9、[2].根據[1]所述的用途，其中，所述干預多肽包含不少于16個氨基酸殘基；

10、任選地，所述干預多肽包含如seq?id?no.1所示序列的第415-450位中至少16個連續的氨基酸殘基；

11、可選地，所述干預多肽包含如seq?id?no.1所示序列的第420-435位的氨基酸殘基；

12、可選地，所述干預多肽包含如seq?id?no.1所示序列的第425-440位的氨基酸殘基；

13、可選地，所述干預多肽包含如seq?id?no.1所示序列的第430-445位的氨基酸殘基。

14、[3].根據[1]或[2]所述的用途，其中，所述破骨細胞過度活化及相關病癥包括骨質疏松癥、骨溶解癥、腫瘤骨轉移、惡性骨腫瘤和/或類風濕性關節炎；

15、優選地，所述破骨細胞過度活化及相關病癥包括骨質疏松癥和/或骨溶解癥。

16、[4].根據[1]所述的用途，其中，所述破骨細胞過度活化及相關病癥所述預防和/或治療破骨細胞過度活化及相關病癥包括以下(i)～(vi)中至少一項：

17、(i)抑制機體中破骨細胞過度分化；

18、(ii)降低機體中破骨細胞的骨吸收和骨侵蝕；

19、(iii)提升機體中骨體積分數；

20、(iv)提升機體中骨小梁數目和厚度；

21、(v)降低機體中骨小梁分離度、孔隙率和孔隙數目；

22、(vi)提升機體中骨密度；

23、所述機體為罹患破骨細胞過度活化及相關病癥的可能性的個體；

24、可選地，所述個體包括哺乳動物；

25、可選地，所述哺乳動物包括小鼠、大鼠、豚鼠、牛、羊、貓、狗、馬、兔、豬、猴和人。

26、[5].根據[1]-[4]中任一項所述的用途，其中，所述預防和/或治療破骨細胞過度活化及相關病癥的產品包括藥物和藥物組合物；

27、可選地，所述藥物組合物還包含一種或多種臨床上治療骨破壞疾病的藥物和/或一種或多種藥學上可接受的載體。

28、[6].根據[1]-[5]中任一項所述的用途，其中，所述藥學上可接受的載體包括溶劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、矯味劑、矯嗅劑、著色劑、粘合劑、崩解劑、填充劑、潤滑劑、潤濕劑、滲透壓調節劑、ph調節劑、穩定劑、表面活性劑和防腐劑中的一種或兩種以上的組合。

29、[7].靶向ch25h的抑制劑在制備預防和/或治療破骨細胞過度活化及相關病癥的產品中的用途，其特征在于，所述靶向ch25h的抑制劑選自降低ch25h轉錄、翻譯表達水平功能的物質；

30、所述靶向ch25h的抑制劑包括核酸、包含核酸的載體、多肽、表達多肽的載體、核糖核蛋白復合體和小分子抑制劑中的至少一種；

31、任選地，所述多肽包括人工鋅指核酸酶和轉錄激活因子樣效應物核酸酶中的至少一種；

32、任選地，所述核酸包括反義rna分子、rna干擾分子和rna適配體中的至少一種；

33、任選地，所述核糖核蛋白復合體包括crispr-cas系統。

34、[8].根據[7]所述的用途，其中，所述破骨細胞過度活化及相關病癥包括骨質疏松癥、骨溶解癥、腫瘤骨轉移、惡性骨腫瘤和/或類風濕性關節炎。

35、[9].根據權利要求[7]或[8]所述的用途，其中，所述破骨細胞過度活化及相關病癥包括骨質疏松癥和/或骨溶解癥。

36、[10].根據[7]-[9]中任一項所述的用途，其中，所述破骨細胞過度活化及相關病癥所述預防和/或治療破骨細胞過度活化及相關病癥包括以下(i)～(vi)中至少一項：

37、(i)抑制機體中破骨細胞過度分化；

38、(ii)降低機體中破骨細胞的骨吸收和骨侵蝕；

39、(iii)提升機體中骨體積分數；

40、(iv)提升機體中骨小梁數目和厚度；

41、(v)降低機體中骨小梁分離度、孔隙率和孔隙數目；

42、(vi)提升機體中骨密度；

43、可選地，所述機體為罹患破骨細胞過度活化及相關病癥的可能性的個體；

44、可選地，所述個體包括哺乳動物；

45、可選地，所述哺乳動物包括小鼠、大鼠、豚鼠、牛、羊、貓、狗、馬、兔、豬、猴和人。

46、發明的效果

47、本發明首次發現ch25h缺失能有效抑制oc分化與功能。

48、本發明首次發現ch25h缺失能有效緩解op和ol癥狀。

49、本發明首次發現ch25h通過酶活非依賴方式與tarf6結合能夠促進oc分化。

50、本發明首次發現ch25h干預多肽能有效抑制oc分化。