本發明涉及一種包裹特定mirna的脂質納米粒及其在神經損傷治療藥物中的應用，屬于生物醫藥。

背景技術：

1、神經再生修復是損傷后恢復功能的關鍵領域，尤其在脊髓損傷(spinal?cordinjury，sci)中，其研究具有重要意義。sci是一種嚴重的中樞神經系統(central?nervoussystem，cns)損傷，通常導致損傷水平以下的運動、感覺或自主功能喪失。據2024年who報道目前全球有超過1500萬人患有sci，發病率和死亡率逐年上升。有效的預防、治療、康復和持續的醫療保健對于減輕全球sci負擔至關重要。與周圍神經系統(peripheral?nervoussystem，pns)的神經損傷不同，pns在發生沃勒氏變性后，斷裂的軸突可能會重新長入遠端神經鞘，并重新支配周圍靶點。而成人cns的可塑性低，神經元再生有限，損傷后的再生極其薄弱。經多年的研究，目前認為創傷性sci可通過長距離軸突再生，構建新的局部中繼神經回路(通過使用外源性神經干細胞/祖細胞(nsc)或使用內源性nsc來實現)。但各種策略的復雜性導致其臨床可實施性極低，因此開發安全有效的臨床治療方法促進神經可塑性、神經發生和重建受損神經回路的治療策略對于改善sci后的神經愈合都是必要的。

2、近年來，神經損傷再生修復的研究逐漸聚焦于多個方面，包括促進神經細胞再生、修復損傷區域的神經連接以及重建神經功能。生物材料的應用、細胞治療和基因編輯技術等前沿手段為神經再生治療提供了新的可能。在神經系統中各種轉錄因子、dna甲基化和染色質結構的表觀遺傳修飾因子以及微小rna(mirna)的活性與促再生轉錄程序的激活有關。mirna的表達依賴于組織和環境。特定的mirna在神經發育中起著關鍵作用，并按照這些作用相對應的時間和空間以特定方式表達。在神經損傷的代表性疾病sci中，創傷發生后，幾個看似獨立的生物過程(例如軸突變性/再生、炎癥、細胞死亡、髓鞘損失)相互交織，在這種情況下，mirna就像一個完美協調的網絡，每個mirna可以作用于不同的mrna，并且一個分子也可以被多個mirna靶向，因此mirna作為內部調控系統，可以精確控制不同的神經過程，協調它們的作用以調控復雜的基因表達網絡。因此sci后找尋特定的mirna分子在體調控，可以促進軸突再生的功能整合，以改善sci后的神經愈合。間充質干細胞外泌體已被證明在sci后神經修復治療中發揮積極作用，而外泌體是穩定的mirna來源，那么外泌體中是否具有通用型功能性治療的核酸分子值得進一步研究，能達到治療效用可進一步開發應用。

3、mirna、mrna、質粒dna等核酸藥物為基因治療提供了治療潛力。然而，裸露的核酸藥物在循環中不穩定、易降解，rna、dna等生物材料所帶的負電荷限制了它們穿過同樣帶負電荷的細胞膜，基于此在sci中應用安全有效的遞送載體傳遞治療性mirna分子是必要的。脂質納米粒(lnp)是一種非凡的載體，自新冠病毒感染mrna疫苗的獲批，lnp加速了mrna在人體中的應用，與其他載體相比，lnp具有包封率高、結構穩定、制備簡單等優勢。可電離的脂質分子被設計為lnp的主要成分，lnp在特定ph下通過相轉化釋放其核酸內容物以發揮調控治療作用。目前fda僅批準了三種用于rna遞送的可電離陽離子脂質。sm-102和alc-0315是首批投入臨床領域遞送mrna的單胺脂質。關于lnp的治療應用主要集中于mrna的遞送疫苗開發及腫瘤治療研究中，利用lnp的遞送性質傳遞mirna治療分子，在神經損傷再生修復治療研究中值得被探索。

技術實現思路

1、針對現有技術的不足，本發明提供一種包裹特定mirna的脂質納米粒及其在神經損傷治療藥物中的應用，以神經損傷模型--sci為例驗證其療效。臍帶間充質干細胞外泌體促進神經損傷修復已被證明具有積極作用，因此本發明的首要目的在于利用外泌體中的積極有效治療成分—mirna，以lnp為遞送載體，以lnp-mirna-mimics形式治療神經損傷，提供治療神經損傷的新方法。

2、本發明的目的通過以下技術方案實現：

3、一種包裹特定mirna的脂質納米粒，所述特定mirna為mirna的分子模擬物，即mirnamimics，包括has-mir939-5p?mimics、has-mir665?mimics、has-mir185-3p?mimics。

4、優選的，所述has-mir939-5p?mimics正義鏈的核酸序列如seq?id?no.1所示，反義鏈的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述has-mir665?mimics正義鏈的核酸序列如seq?idno.3所示，反義鏈的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；所述has-mir185-3p?mimics正義鏈的核酸序列如seq?id?no.5所示，反義鏈的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

5、優選的，所述脂質納米粒的脂質成分包括：alc-0315、dspc、膽固醇、alc-0159。

6、進一步優選的，所述alc-0315、dspc、膽固醇、alc-0159的摩爾比為46.3：9.4：42.7：1.6。

7、本發明中，所述的包裹特定mirna的脂質納米粒lnp-mirna-mimics的粒徑范圍為50～125nm，分散性指數(pdi)小于0.2，zeta電位范圍為-15～+15mv。

8、上述包裹特定mirna的脂質納米粒的制備方法，包括如下步驟：

9、1)將alc-0315、dspc、膽固醇、alc-0159以乙醇為溶劑分別配制為脂質儲備液，按比例混合后配置為復方-乙醇溶液；

10、2)利用檸檬酸鈉緩沖液將mirnamimics稀釋至工作濃度，得到水相溶液；

11、3)將復方-乙醇溶液和水相溶液混合，自主形成lnp-mirna-mimics復合物，并利用pbs緩沖液稀釋；

12、4)通過超濾將lnp-mirna-mimics復合物利用pbs緩沖液置換，使乙醇含量降至0.5％以下，然后濃縮；

13、5)向濃縮后的lnp-mirna-mimics復合物中添加蔗糖作為冷凍保護劑，經0.22μm過濾后得到包裹特定mirna的脂質納米粒，即lnp-mirna-mimics。

14、優選的，步驟1)中所述的脂質儲備液濃度為5～12.5mg/ml。

15、進一步優選的，步驟1)中所述的脂質儲備液濃度為10mg/ml。

16、優選的，步驟2)中所述的水相溶液中has-mir939-5p?mimics、has-mir665mimics、has-mir185-3p?mimics的質量比為1:1:1，水相溶液中總mirnamimics的工作濃度以步驟3)所述的lnp-mirna-mimics復合物中包含0.4～1mg/ml的lnp-mirna-mimics計算配制。

17、進一步優選的，水相溶液中總mirnamimics的工作濃度以步驟3)所述的lnp-mirna-mimics復合物中包含0.5mg/ml的lnp-mirna-mimics計算配制。

18、優選的，步驟3)中所述的pbs緩沖液稀釋為加入lnp-mirna-mimics復合物2～3倍體積的pbs緩沖液進行稀釋，以保持lnp-mirna-mimics復合物穩定性，否則高濃度的乙醇會造成脂質納米粒融合；所述的pbs緩沖液的ph為6.9～7.9。

19、優選的，步驟4)中所述的超濾為使用100kda超濾離心管3000～4000×g離心10～15min；所述的pbs緩沖液的ph為6.9～7.9。

20、優選的，步驟5)中所述的蔗糖濃度為最終溶液中含8％～10％蔗糖，輕輕混勻后保存。

21、進一步優選的，步驟5)中所述的蔗糖濃度為最終溶液中含10％蔗糖。

22、上述包裹特定mirna的脂質納米粒在制備神經損傷治療藥物中的應用。

23、優選的，所述包裹特定mirna的脂質納米粒能夠促進神經損傷再生修復；

24、進一步優選的，所述包裹特定mirna的脂質納米粒能夠促進脊髓損傷后的行為恢復、肌肉恢復及損傷部位的神經元恢復。

25、有益效果：

26、(1)間充質干細胞外泌體已被證明在治療神經性損傷中發揮積極作用，本發明在前期研究中發現間充質干細胞外泌體中的特定mirna可以作為神經損傷的有效治療成分，所述的mirna包括has-mir939-5p、has-mir665、has-mir185-3p。基于此，本發明直接利用外泌體中的有效成分mirna的分子模擬物(mirnamimics)，提供了一種脂質納米粒遞送特定mirna體系(lnp-mirna-mimics)用于治療神經損傷，不僅克服了直接利用外泌體治療的異質性問題，還解決了外泌體產出率低、大規模生產純化困難等問題，通過lnp遞送方式實現lnp-mirna-mimics在神經損傷治療中的應用，實現了單純成分治療策略，進一步開發lnp治療神經損傷的應用價值。

27、(2)本發明采用可電離脂質alc-0315、輔助脂質dspc、結構脂質膽固醇和聚乙二醇脂質alc-0159為載體制備了lnp-mirna-mimics治療體系，mirna?mimics是來源于臍帶間充質干細胞外泌體中的mirna的分子模擬物，其中包含has-mir939-5p?mimics、has-mir665mimics、has-mir185-3p?mimics三類mimics。相較于直接將臍帶間充質干細胞外泌體應用于治療神經損傷，lnp-mirna-mimics治療體系更加均一，重復性好，是良好的遞送治療方案。