本發明屬于中藥檢測，具體涉及一種百蕊草水提物及其制劑的特征圖譜的構建方法。

背景技術：

1、百蕊草為檀香科植物百蕊草thesium.chinense?turcz.的干燥全草，具有清熱解毒，消腫功效；具有抗病毒、抗菌、抗炎鎮痛、鎮咳等作用；可用于感冒發熱，扁桃體炎，咽喉炎，支氣管炎，肺炎，肺膿瘍，乳腺炎，癤腫。百蕊草含有黃酮、有機酸、生物堿、甾醇、酚類等，主要成分為黃酮類，包括百蕊草素i～iv、紫云英苷、山奈酚、槲皮素、蘆丁等。目前僅有部分地方標準對百蕊草中含量成分進行單一控制，現行版各法定標準收載的百蕊草藥材及飲片均無特征圖譜項內容。現有文獻中公開了部分對百蕊草特征圖譜的研究，但其獲得的特征圖譜中存在特征峰個數較少，個別峰響應值較低，且分離度難達標、重現較為困難的缺陷；且部分方法中特征峰數目較少，s峰與其他峰相距較遠，出峰不集中。

技術實現思路

1、因此，本發明的目的在于提供一種百蕊草水提物及其制劑的特征圖譜的構建方法，該方法根據百蕊草水提物及其制劑的特點，建立了該品種的特征圖譜，特征峰個數多且分離度高，共10個共有特征峰指認其中7個，特征峰保留時間分布均勻，特征性明顯，重復性良好，可對百蕊草水提物及其制劑進行全面質量控制。

2、為此，本發明提供了如下的技術方案：

3、本發明提供一種百蕊草水提物及其制劑的特征圖譜的構建方法，包括如下步驟：(1)供試品溶液的制備；(2)取供試品溶液采用高效液相色譜法檢測，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相包括含磷酸的水溶液和甲醇，梯度洗脫程序包括：0→10min→18～20min→25～30min→32～35min，流動相中甲醇的體積百分數為：2％→5％→40％～42％→46％～48％→55％，檢測波長為240～320nm。

4、可選的，步驟(2)還滿足如下1)～4)中的至少一項：

5、1)在檢測的前18min，檢測波長為240～254nm，18min后為300～320nm；

6、2)流速為0.6～0.8ml/min，柱溫為20～30℃；可選的，流速為0.7ml/min，柱溫為25℃；

7、3)檢測過程中采用規格4.6mm×150mm，2.7μm的色譜柱；

8、4)進樣體積為5～10μl；可選的，為10μl；

9、5)所述含磷酸的水溶液中磷酸的體積百分數為0.08％～0.12％；可選的，為0.1％。

10、可選的，梯度洗脫程序包括：0→10min→19min→28min→32min→35min，流動相中甲醇的體積百分數為：2％→5％→40％→47％→55％→55％。

11、可選的，所述步驟(1)中包括，稱取百蕊草供試品，加溶劑提取，得到提取液，固液分離，取液體，即為供試品溶液。

12、可選的，所述步驟(1)還滿足如下a～f中的任意一項或者多項：

13、a、當百蕊草供試品為百蕊草制劑時，百蕊草供試品與溶劑的質量體積比為0.1～0.5g：20ml；可選的，百蕊草供試品與溶劑的質量體積比為0.2g：20ml；

14、b、當百蕊草供試品為百蕊草藥材或百蕊草飲片時，在加溶劑提取前還包括將百蕊草供試品進行水提取的步驟；可選的，所述水提取包括向百蕊草供試品中以質量體積比0.5～1.2g：50ml加入水，稱定重量，回流30～60min，取出，過濾，蒸干，得到殘渣；后使用所述殘渣進行加溶劑提取的步驟，百蕊草供試品與溶劑的質量體積比為0.5～1.2g：20ml；可選的，百蕊草供試品與溶劑的質量體積比為0.8g：20ml；

15、c、提取方式包括超聲提取或回流提取；可選的，所述超聲提取的功率為400～600w，頻率為30～50khz；

16、d、提取時間為30～60min；可選的，所述提取時間為30min；

17、e、所述固液分離選自離心或者過濾；

18、f、溶劑選自甲醇、水中的一種或者多種；可選的，為體積百分數10％～50％甲醇的水溶液或水。

19、可選的，所述的構建方法還包括采用百蕊草素i、腺苷、尿苷、鳥苷、5-o-阿魏酰奎寧酸、4-o-阿魏酰奎寧酸、6”-丙二酰百蕊草素i中的至少一種加溶劑制備對照品溶液的步驟，以及按照上述構建方法中的高效液相色譜法檢測對照品溶液得到對照品圖譜的步驟；和/或，采用百蕊草對照藥材為參照物按照上述構建方法中的步驟(1)制備對照品參照物溶液，按照上述構建方法中的高效液相色譜法檢測對照品參照物溶液得到對照品參照物圖譜的步驟。

20、可選的，每1ml對照品溶液中含對照品5～100μg；可選的，1ml對照品溶液中含百蕊草素i90～100μg；可選的，1ml對照品溶液中含腺苷5～15μg；可選的，1ml對照品溶液中含尿苷5～15μg；可選的，1ml對照品溶液中含鳥苷5～15μg；可選的，1ml對照品溶液中含5-o-阿魏酰奎寧酸20～30μg；可選的，1ml對照品溶液中含4-o-阿魏酰奎寧酸20～30μg；可選的，1ml對照品溶液中含6”-丙二酰百蕊草素i?20～30μg。

21、可選的，對照品溶液制備中所采用的溶劑為甲醇。

22、可選的，所述百蕊草水提物及其制劑的特征圖譜滿足如下(1)～(2)的至少一項：

23、(1)具有10個共有特征峰，峰2為尿苷，峰3為腺苷，峰4為鳥苷，峰7為5-o-阿魏酰奎寧酸，峰8為4-o-阿魏酰奎寧酸，峰9為百蕊草素i，峰10為6”-丙二酰百蕊草素i；

24、(2)具有10個共有特征峰，峰3與腺苷對照品參照物峰保留時間相對應，與腺苷對照品參照峰相對應的峰為s1峰，峰9與百蕊草素i對照品參照物峰保留時間相對應，與百蕊草素i對照品參照峰相對應的峰為s2峰，峰1、峰2、峰4與s1峰的相對保留時間在規定值的±10％的范圍內，峰5～峰8、峰10與s2峰的相對保留時間在規定值的±10％的范圍內；規定值為：0.44(峰1)、0.84(峰2)、1.41(峰4)、0.62(峰5)、0.75(峰6)、0.77(峰7)、0.85(峰8)、1.08(峰10)。

25、本發明提供如上述百蕊草水提物及其制劑的特征圖譜的構建方法在百蕊草藥物制劑的質量檢測中的應用。

26、本發明還提供一種百蕊草水提物及其制劑的質量檢測方法，包括將待測百蕊草產品的特征圖譜與百蕊草水提物及其制劑的對照特征圖譜進行比較的步驟；所述待測百蕊草產品的特征圖譜為使用待測百蕊草產品按照上述構建方法構建得到，所述百蕊草水提物及其制劑對照特征圖譜選自如下(1)～(3)中任意一項：

27、(1)具有10個共有特征峰，峰3與腺苷對照品參照物峰保留時間相對應，與腺苷對照品參照峰相對應的峰為s1峰，峰9與百蕊草素i對照品參照物峰保留時間相對應，與百蕊草素i對照品參照峰相對應的峰為s2峰，峰1、峰2、峰4與s1峰的相對保留時間在規定值的±10％的范圍內，峰5～峰8、峰10與s2峰的相對保留時間在規定值的±10％的范圍內；規定值為：0.44(峰1)、0.84(峰2)、1.41(峰4)、0.62(峰5)、0.75(峰6)、0.77(峰7)、0.85(峰8)、1.08(峰10)；

28、(2)使用單批次或者多批次百蕊草水提物和/或其制劑按照上述構建方法得到的百蕊草水提物和/或其制劑的特征圖譜；

29、(3)使用多批次百蕊草水提物和/或其制劑按照上述構建方法得到的特征圖譜通過平均值或者中位數法制成對照特征圖譜。

30、本發明技術方案，具有如下優點：

31、1.本發明提供的百蕊草水提物及其制劑的特征圖譜的構建方法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相包括含磷酸的水溶液和甲醇，通過特定的梯度洗脫程序及特定檢測波長，得到10個共有特征峰，特征峰數量較多，其中實現了包括腺苷峰、百蕊草素ⅰ峰在內的共有特征峰的分離，且洗脫程序快速、簡單，得到的特征圖譜結果清晰、基線平穩，特征峰峰形好、分離度高、響應適中，峰1、峰2、峰4與s1峰，峰5～峰8、峰10與s2峰的距離較近，出峰分布均勻，能夠全面反映百蕊草水提物及其制劑內在質量和用藥安全，更為全面、客觀、快速地為百蕊草水提物及其制劑的質量檢測和控制提供依據。還可以準確定位尿苷、鳥苷、5-o-阿魏酰奎寧酸、4-o-阿魏酰奎寧酸、6”-丙二酰百蕊草素i的峰位置，充分的反映百蕊草水提物及其制劑的整體性和特征性。

32、2.本發明提供的百蕊草水提物及其制劑的特征圖譜的構建方法，根據百蕊草化學成分、藥理藥效作用、水煎提取工藝等藥材自身特點，選擇與藥味功效相關的黃酮類、核苷類等水溶性成分作為研究主要成分，通過優化色譜條件、檢測波長、提取溶劑、提取方式、提取溶劑用量等提取條件進行考察，確定了最佳提取工藝和色譜條件，使得峰響應更高，分離效果更好，能夠更加全面的對百蕊草水提物及其制劑進行質量監控。且本方法的供試品處理制作簡便，色譜條件容易實現，操作簡便、結果準確、方法重現性較好。

33、3.本發明所述的百蕊草水提物及其制劑的質量檢測方法，通過待測百蕊草水提物及其制劑產品的特征圖譜與百蕊草水提物及其制劑的對照特征圖譜進行比較，可以全面、清楚、有效對百蕊草水提物及其制劑進行質量檢測。