本發明涉及肝素鈉原料藥，尤其涉及一種肝素鈉原料藥及其制備方法。

背景技術：

1、肝素鈉是一種酸性黏多糖，具有抗凝血的作用。肝素鈉作為一種天然抗凝血物質而受到了世界各國的重視。肝素鈉用于臨床雖有60余年的歷史，但到目前為止還沒有一種能夠完全代替它的產品，所以它仍然是最重要抗凝血和抗血栓的生化藥物之一。肝素具有強抗凝作用，是防治深層靜脈血栓形成等血栓栓塞性疾病的首選藥物，隨著研究的深入，人們發現肝素不但有抗凝、抗血栓形成和調整血脂的作用，還有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌等多種生物學功能。

2、肝素鈉原料藥來源于肝素粗品。肝素粗品源自健康動物的小腸粘膜，其中含有大量雜蛋白、雜核酸、微生物等，需經過物理和化學提取分離過程，定向獲取天然結構基團完整的肝素，從而制成肝素鈉原料藥。但我國生產的肝素原料藥產品存在著效價低，提取率低的問題，大多數是以粗品肝素鈉的形式低價出口到國外。針對目前肝素鈉生產存在的問題，研究高效提取和分離純化肝素技術，具有重要意義。

3、但現有肝素鈉提取純化方法大多是采用酸堿處理去除雜質蛋白、核酸等物質，采用多次氧化的方法去除色素類物質，采用乙醇多次分級的方式去除等雜多糖。上述酸堿處理的方式易造成核酸、色素的殘留量高，導致后續氧化次數增多；酸處理及多次氧化易導致肝素鈉部分失活，難以得到高效價的肝素鈉；多次乙醇分級易造成收率降低及物料的浪費。

4、酶法提取肝素多糖的優點是作用條件溫和，通過酶法去除蛋白質雜質可以明顯提高得率。但該技術同時存在一定的局限性：(1)酶的最適溫度及最適ph值往往在一個很小的范圍內，為使酶的活性提高到最大值，必須嚴格控制酶反應溫度和ph，反應條件的微小波動都可能使酶的活性大大降低，因此對試驗設備的要求較高。(2)酶法提取過程中，酶有可能會與多糖產生反應，使多糖降解。(3)酶本身也是蛋白質，因此在提取肝素以后還要滅酶、除去蛋白質雜質。

5、北京大學的周先琬研究采用酶水解法精制肝素鈉，取得了較好的效果(周先琬，何偉.酶降解法精制肝素鈉.中國生物化學與分子生物學報，1999，6(18):488-490)。但在制備中測定酶解液肝素含量一般在10萬u/l以上，但通過離子交換從酶解液中吸附的肝素鈉卻不完全，殘留液中往往含較高量的肝素鈉，從而影響肝素鈉收率。這就要求首先選取吸附效果好、吸附能力強、能耐堿、耐熱的樹脂；并確定樹脂最佳的吸附條件。

技術實現思路

1、基于背景技術中存在的技術問題，本發明提出了一種肝素鈉原料藥及其制備方法，具有操作簡單，工藝時間短，產品收率高的特點，所得肝素鈉不僅純度高，活性高，而且用于注射級肝素鈉原料藥。

2、本發明提出的一種肝素鈉原料藥的制備方法，包括如下步驟：

3、s1、將肝素鈉粗品溶于氯化鈉溶液中，得到粗品溶液；

4、s2、將所述粗品溶液酶解后，醇沉，得到沉淀物；

5、s3、將所述沉淀物溶解后，上強堿性陰離子交換柱純化，得到洗脫液；

6、s4、將所述洗脫液再上弱堿性陰離子交換柱純化后，即得到所述肝素鈉原料藥；

7、步驟s3中，所述強堿性陰離子交換柱中填充有強堿性季銨型陰離子樹脂，其是將叔胺陰離子交換樹脂和鹵代季銨鹽進行季胺鹽化反應得到；

8、步驟s4中，所述弱堿性陰離子交換柱中填充有弱堿性咪唑型陰離子樹脂，其是將伯胺陰離子交換樹脂和烯基酰氯進行縮合反應后，再和乙烯基咪唑進行共聚反應得到。

9、本發明中，肝素鈉粗品經過酶解后，將肝素鈉從蛋白質復合物中充分游離出來；肝素鈉先經過強堿性陰離子交換柱純化，除去雜蛋白以及雜多糖等雜質，再經過弱堿性陰離子交換柱脫色，除去色素等雜質；本發明通過強堿性陰離子交換柱以及弱堿性陰離子交換柱兩步純化，避免了引入異物，提高肝素鈉的活性，并且還保證了產品的純度。

10、本發明中，強堿性陰離子交換柱中填充有強堿性季銨型陰離子樹脂，其是將叔胺陰離子交換樹脂作為母體，利用其所具有的叔胺基團與鹵代季銨鹽進行季胺鹽化反應，如此在交換樹脂的骨架上引入大量季銨陽離子結構，得到季銨陽離子量更高的陰離子交換樹脂，實現對肝素鈉、雜蛋白以及雜多糖等更大區別的保留效果，從而實現對肝素鈉的有效分離和純化，并獲得更高的回收效率。

11、本發明中，弱堿性陰離子交換柱中填充有弱堿性咪唑型陰離子樹脂，其是將伯胺陰離子交換樹脂作為母體，利用其所具有的伯胺基團與烯基酰氯進行縮合反應，如此在交換樹脂的骨架上引入大量烯基結構，其可以和乙烯基咪唑進行共聚反應，從而可得到具有聚乙烯咪唑側鏈的陰離子交換樹脂，利用咪唑基團和肝素鈉的親和作用，從而進一步純化肝素鈉并實現脫色。

12、優選地，步驟s1具體包括：將肝素鈉粗品加入2-3wt％的氯化鈉溶液中，加熱至45-55℃后攪拌4-6h，得到粗品溶液；

13、優選地，所述肝素鈉粗品與氯化鈉溶液的質量體積比為1g:5-10ml。

14、優選地，步驟s2中，所述酶解具體包括：將所述粗品溶液調節至ph為7.5-8.5，并加熱至45-55℃，加入胰蛋白酶，保溫3-5h后，升溫至85-95℃滅活，得到酶解液；

15、優選地，所述胰蛋白酶的加入量是肝素鈉粗品質量的1-3％；

16、優選地，所述醇沉具體包括：將所述酶解液加入體積1-2倍的95％乙醇，攪拌均勻后，靜置沉淀4-6h，過濾后，得到沉淀物。

17、優選地，步驟s3具體包括：將所述沉淀物加入純化水溶解后，調節ph至8.0-9.0，升溫至40-50℃后上柱，上柱速度為1.0-1.5bv/h，完成后，先后洗脫雜質和肝素鈉，得到洗脫液；

18、優選地，洗脫雜質包括：先用2-3bv的40-50℃的蒸餾水洗滌，流速為2-3bv/h，再用3-4bv的5-8wt％的氯化鈉溶液洗滌，流速為1-2bv/h；

19、優選地，洗脫肝素鈉包括：用2-3bv的溫度為40-50℃、20-25wt％的氯化鈉溶液洗脫，流速為0.5-1bv/h。

20、優選地，所述強堿性季銨型陰離子樹脂中，叔胺陰離子交換樹脂為d301樹脂，鹵代季銨鹽為2-氯乙基三甲基氯化銨、3-氯丙基三甲基氯化銨或4-氯丁基三甲基氯化銨中的至少一種；

21、優選地，叔胺陰離子交換樹脂和鹵代季銨鹽的質量比為1:0.3-0.5。

22、優選地，所述強堿性季銨型陰離子樹脂在用于強堿性陰離子交換柱之前，還包括將強堿性季銨型陰離子樹脂加入體積1-2倍的95％乙醇中攪拌1-2h，再加入體積4-6倍的1-3mo1/l的鹽酸中攪拌1-2h，之后加入體積2-4倍的濃度為1-3mo1/l的氫氧化鈉溶液攪拌2-3h。

23、優選地，步驟s4具體包括：將所述洗脫液上柱，上柱速度為1.0-1.5bv/h，完成后，先后洗脫雜質和肝素鈉，得到肝素鈉純品溶液，凍干，粉碎后，即得到所述肝素鈉原料藥；

24、優選地，洗滌雜質包括：用2-3bv的溫度為40-50℃的蒸餾水洗滌，流速為2-3bv/h；

25、優選地，洗脫肝素鈉包括：用2-3bv的溫度為40-50℃、5-10wt％的氯化鈉溶液洗脫，流速為0.5-1bv/h。

26、優選地，所述弱堿性咪唑型陰離子樹脂中，伯胺陰離子交換樹脂為d318樹脂，烯基酰氯為2-丁烯酰氯、丙烯酰氯或甲基丙烯酰氯中的至少一種，乙烯基咪唑為n-乙烯基咪唑；

27、優選地，伯胺陰離子交換樹脂、烯基酰氯和乙烯基咪唑的質量比為1:0.05-0.2:0.3-0.5。

28、優選地，所述弱堿性咪唑型陰離子樹脂用于弱堿性陰離子交換柱之前，還包括將弱堿性咪唑型陰離子樹脂加入體積2-4倍的95％乙醇中浸泡1-2h。

29、本發明還提出一種肝素鈉原料藥，其是上述制備方法制備得到。

30、與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

31、本發明中，肝素鈉粗品溶液經過酶解脫脂處理后，將肝素鈉從蛋白質復合物中充分游離出來，避免了過多油脂對離子交換中樹脂的干擾，大大提高了樹脂的吸附能力和利用率；在利用離子交換樹脂純化過程中，采用強堿性陰離子交換柱和弱堿性陰離子交換柱兩步純化相結合，最大限度地使肝素鈉與蛋白質解離，較為徹底地去除了蛋白質、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素等雜質，使肝素鈉成品的純度、活性和收率都有大幅度提高，獲得了較理想的提取效果。