本發明涉及微生物監測，具體而言，涉及一種表達綠色熒光的殺香魚假單胞菌重組菌株及其構建方法和應用。

背景技術：

1、大黃魚是我國東部沿海網箱養殖的重要經濟魚類品種，其養殖過程中受到殺香魚假單胞菌（pseudomonas?plecoglossicida）的危害，造成內臟白點病，導致較高的死亡率和嚴重的經濟損失。魚體感染初期沒有明顯外觀癥狀，后期內臟組織如肝、腎、脾中出現大小不一的白色結節，此時魚已病重不能攝食，往往無法通過藥物投喂的方法有效控制。殺香魚假單胞菌屬于革蘭氏陰性桿菌，假單胞菌屬、惡臭假單胞菌組。該菌感染魚體后，進入組織中的巨噬細胞，不同的研究者相繼觀察到了胞內生存和增殖現象，表明該菌屬于兼性胞內病原菌。雖然目前已有一些關于殺香魚假單胞菌致病機理的研究，但這些研究尚未完全開展，仍存在較大的技術空白。

2、目前，針對殺香魚假單胞菌的研究多集中在其致病機制和防控方法上，但缺乏一種有效的、可以實時監控和可視化病原菌與宿主相互作用的工具。殺香魚假單胞菌與宿主的相互作用，尤其是病原菌在宿主細胞內的動態變化，尚未得到深入研究。這主要由于缺乏能夠實時、直觀觀察病原菌感染過程的手段和技術。

3、熒光標記技術作為一種常用的生物標記方法，可以通過標記病原菌和宿主細胞，幫助研究人員觀察病原菌感染宿主的過程。綠色熒光蛋白（gfp）作為一種理想的報告基因，具有無需外源底物或輔助因子即可在活細胞中表達的優點，且其發光特性無需額外的輻射或化學物質，避免了放射性污染和其他潛在危害。因此，gfp可廣泛用于活體跟蹤實驗中，成為研究微生物與宿主相互作用、病原感染機制的理想工具。

4、然而，盡管在許多病原菌研究中已經使用了gfp標記技術，但在殺香魚假單胞菌的研究中，仍缺乏一種綠色熒光標記的重組菌株。現有的技術無法提供足夠直觀的手段，以便深入了解殺香魚假單胞菌在宿主內的感染過程和病理變化。此外，現有技術中的重組菌株的表達能力、穩定性以及在宿主細胞和動物模型中的可視化觀察都存在一定的局限性。因此，構建一種能夠穩定表達綠色熒光的殺香魚假單胞菌重組菌株，成為了解病原菌感染機制、提高診斷與防控效率的迫切需求。

技術實現思路

1、本發明要解決的第一個技術問題是提供一種表達綠色熒光的殺香魚假單胞菌重組菌株，以解決現有技術中無法實時、動態地監測宿主細胞或動物體內的分布和增殖的問題。

2、為克服以上現有技術的缺陷，本發明提供了一種表達綠色熒光的殺香魚假單胞菌重組菌株，所述重組菌株是由質粒pbbr1-gfp轉化殺香魚假單胞菌nb2011獲得的陽性克隆，且該重組菌株能夠在熒光顯微鏡下呈現綠色熒光，所述質粒pbbr1-gfp的序列如seq?idno:2所示，所述質粒pbbr1-gfp的綠色熒光片段如seq?id?no:1所示。

3、本發明一種表達綠色熒光的殺香魚假單胞菌重組菌株與現有技術相比，具有以下優點：增強的可視化能力：通過將綠色熒光蛋白（gfp）基因導入殺香魚假單胞菌，能夠在熒光顯微鏡下實時觀察細菌的生長、定殖及增殖過程，克服了傳統方法中無法實現細菌在宿主細胞或動物體內動態監測的問題；高穩定性：通過使用質粒pbbr1-gfp，所構建的重組菌株表現出高度的熒光穩定性，且質粒在多代傳代中保持穩定，保證了長期追蹤實驗的可靠性。這解決了現有技術中熒光標記不穩定的問題，使得該技術在長期實驗中可持續應用；廣泛應用前景：該重組菌株不僅能夠在細胞培養系統中進行動態觀察，還能在動物模型（如斑馬魚模型）中使用，為研究細菌與宿主的相互作用提供了更為直觀和可靠的實驗平臺，具有重要的應用價值；通過上述技術優點，本發明的重組菌株還包括以下的金屬進步：熒光標記的穩定性增強：現有技術中，熒光標記方法往往存在標記強度不穩定的問題，而本發明采用的pbbr1-gfp質粒，能保證綠色熒光蛋白在殺香魚假單胞菌中的穩定表達，使得細菌在細胞和動物體內的實時追蹤成為可能。改善了監測的精度和可靠性：通過引入綠色熒光標記，能夠更準確地監測細菌在宿主中的分布，避免了傳統方法中只能觀察外部癥狀的問題；提供了有效的工具：本發明所提供的綠色熒光表達的殺香魚假單胞菌重組菌株，為研究細菌的致病機制、宿主免疫反應及細菌與宿主相互作用提供了一種直觀且高效的實驗工具。

4、本發明要解決的第二個技術問題是提供一種表達綠色熒光的殺香魚假單胞菌重組菌株的構建方法，以解決現有技術中常規技術存在的低效、難以穩定標記殺香魚假單胞菌、并且難以長期觀察細菌在宿主內分布和增殖的問題。

5、為克服以上現有技術的缺陷，本發明提供了一種所述表達綠色熒光的殺香魚假單胞菌重組菌株的構建方法，包括以下步驟：

6、s1：質粒pbbr1-gfp的提取；

7、s2：殺香魚假單胞菌感受態細胞的制備；

8、s3：電擊法構建表達綠色熒光的殺香魚假單胞菌重組菌株；

9、s4：陽性克隆的篩選，得到表達綠色熒光的殺香魚假單胞菌重組菌株。

10、本發明一種表達綠色熒光的殺香魚假單胞菌重組菌株的構建方法與現有技術相比，具有以下優點：提高轉化效率：現有技術中的細菌轉化方法通常效率較低，且難以保證轉化后的菌株穩定表達綠色熒光。通過本發明采用電擊法，成功提高了殺香魚假單胞菌轉化的效率，使得綠色熒光蛋白（gfp）能夠在細菌中高效穩定表達，從而解決了現有方法中轉化效率低和穩定性差的問題；熒光穩定性和長期觀察：傳統的標記方法往往無法保證標記基因的長期穩定表達，導致在長時間觀察過程中熒光信號可能減弱或消失，無法實現持續的追蹤研究。而通過引入質粒pbbr1-gfp，本發明的重組菌株能夠穩定表達綠色熒光蛋白，即使經過多代傳代，綠色熒光的表達也能維持穩定，解決了現有技術中難以進行長期動態觀察的問題；簡單且高效的構建過程：與傳統方法相比，本發明的構建方法不僅操作簡便，而且具有較高的成功率。通過優化的電擊轉化法和篩選過程，大大縮短了構建時間，且減少了因標記不穩定或轉化失敗而帶來的實驗誤差，使得該方法具備了廣泛的適用性，尤其適合大規模實驗的開展。

11、在一種可能的實施方式中，所述步驟s1包括：通過質粒提取試劑盒提取質粒pbbr1-gfp，提取后測定質粒濃度，使質粒濃度達到5pg-25ng/μl。

12、與現有技術相比，采用上述技術方案，能夠得到高濃度和高純度的質粒，質粒濃度控制在5pg-25ng/μl的范圍內，確保質粒的有效性和轉化效率，在后續的電轉化過程中，高濃度的質粒能夠提高轉化的成功率，減少不必要的實驗誤差，確保綠色熒光基因在目標細菌中的穩定表達，確保了標記穩定性的技術效果，有助于進行后續細菌的標記與追蹤實驗。

13、在一種可能的實施方式中，所述步驟s2包括：

14、s21：使用lb培養液通過搖床振蕩培養殺香魚假單胞菌，測量所述培養液的od600值，待od600值為0.6時，將菌液冰浴處理15-30min，且輔以搖晃以保證菌液充分冷卻；

15、s22：離心處理所述步驟s21得到的菌液，隨后回收細胞，使用純水重懸細胞后再次離心洗滌，將其中的電解質雜質洗掉，并逐步通過甘油重懸、洗滌，最后以甘油進行重懸沉淀，得到懸液；

16、s23：稀釋所述步驟s22得到的懸液后測量od600值，用10％甘油將其稀釋至濃度為2×1010cells/ml，分裝后保存。

17、與現有技術相比，采用上述技術方案，使用lb培養液培養殺香魚假單胞菌，通過控制培養至od600值為0.6時進行冰浴處理，這有助于細胞的冷卻和感受態細胞的有效形成；而進一步的通過離心和甘油重懸步驟，去除其中的電解質雜質，并使用甘油作為保護劑，確保細胞在冷凍保存時不會發生損傷。此方法有效提高了細胞膜的通透性，使其能夠有效地接受外源質粒的轉入。

18、在一種可能的實施方式中，所述步驟s21中，所述搖床振蕩培養的條件為：28℃、180rpm；所述步驟s22中，所述離心處理的條件為4℃、4000g，時間為10min；所述步驟s23中，所述分裝并保存的條件為：以100?μl/1.5?ml?ep管進行分裝，且在-80℃的條件下保存。

19、與現有技術相比，采用上述技術方案，通過進一步地優化培養和離心條件，使得細胞在最佳的生長階段被采集，從而獲得高質量的感受態細胞，其中28℃是殺香魚假單胞菌的最佳生長溫度，180rpm的振蕩速度有助于提供足夠的氧氣供應，確保細菌處于對數生長期，細胞數量達到最適合轉化的水平；而低溫4℃能夠有效抑制細胞代謝活動，減少溫度對細胞損傷的影響，通過高轉速離心（4000g），可以快速沉降細胞，并去除培養液中的雜質；在-80°c下分裝保存細胞懸液，以100?μl/1.5?ml?ep管為單位分裝，甘油作為保護劑可防止細胞在冷凍過程中結冰損傷，上述分裝方法，細胞可在-80°c下長期保存，并且在復蘇后仍能保持較好的轉化能力，極大提高了保存期內細胞的活性與轉化效率。

20、在一種可能的實施方式中，所述步驟s3包括：

21、s31：制備感受態細胞：將新鮮制備或凍融的殺香魚假單胞菌感受態細胞轉移至冰冷的無菌離心管中，并與電轉化儀樣品池一同冰上冷卻；

22、s32：加入質粒：向所述步驟s32處理后的無菌離心管加入10pg-25ng的待轉化質粒，保持冰冷，靜置30-60秒得到混合液；

23、s33：電轉化操作：向所述步驟s32的混合液中施加電脈沖進而電轉化；

24、s34：復蘇轉化細胞：待所述步驟s33的電轉化操作結束后，將所述混合液取出，室溫下加入1ml?lb液體培養基，在28℃、180rpm條件下振蕩培養以復蘇細菌；

25、s35:篩選陽性克隆：取所述步驟s34處理后得到的不同體積的轉化細菌涂布至含氯霉素的lb瓊脂平板，培養后篩選出含綠色熒光的重組菌；

26、s36：克隆鑒定：在24小時后，挑取單菌落進行陽性克隆鑒定。

27、與現有技術相比，采用上述技術方案，通過多個優化步驟來提高轉化效率并確保成功構建穩定的綠色熒光標記的殺香魚假單胞菌重組菌株：首先，通過使用冰冷條件和凍融方法制備感受態細胞（步驟s31），能夠有效地提高細胞膜的通透性，從而使細胞處于最佳狀態以接受外源質粒的轉化，在低溫條件下，細胞的代謝活動得到抑制，細胞膜更加穩定，便于質粒進入細胞；接著，向冷卻的細胞中加入質粒dna（步驟s32），并保持在低溫下，以避免質粒在轉化過程中因溫度升高而降解或擴散，加入適當量的質粒（10pg-25ng）確保了轉化過程中dna量的充足，從而提高轉化的成功率；通過電轉化操作（步驟s33），施加電脈沖暫時性打開細胞膜，從而讓質粒能夠進入細胞內，與傳統的化學轉化方法相比，電轉化具有更高的轉化效率，尤其對于細胞膜較厚或較難轉化的細菌效果更佳。電轉化后，細胞在培養基中復蘇（步驟s34），此過程能夠在溫和的培養條件下使轉化的質粒得以表達，同時確保細胞恢復到適合增殖的狀態，其不僅有助于細菌的復蘇，還能進行后續篩選；在篩選過程中，轉化細菌被涂布在含氯霉素的lb瓊脂平板上（步驟s35），只有成功轉化質粒的細菌能夠在含氯霉素的環境中生長，這一篩選過程通過綠色熒光標記進一步確認陽性克隆；最后，通過挑選單菌落進行克隆鑒定（步驟s36），確保每一個陽性克隆都能穩定表達綠色熒光蛋白，從而驗證所選重組菌株的可靠性和穩定性，確保實驗的成功進行。

28、在一種可能的實施方式中，所述步驟s33中，所述電脈沖的條件為：電轉儀參數為25uf、25kv、200ω，電場強度為12.5?kv/cm，持續4-5毫秒；所述步驟s35中，所述培養的條件為：28℃培養12-16小時。

29、與現有技術相比，采用上述優化的技術方案，進一步提高了轉化效率和菌株篩選的穩定性，通過精確調整電轉化過程中的電場強度和持續時間（25uf、25kv、200ω和12.5kv/cm電場強度，持續4-5毫秒），能夠更加高效地促進質粒進入細胞，提高轉化成功率，尤其對于較難轉化的細菌。通過優化的培養條件（28℃培養12-16小時），有效地促進了轉化細菌的復蘇與增殖，確保了陽性克隆的篩選效果，使得綠色熒光的穩定表達更加可靠。

30、在一種可能的實施方式中，所述步驟s4包括：

31、s41：配制lb肉湯培養基或lb瓊脂培養基，高壓滅菌后，待其溫度降至50-55℃時，加入氯霉素使其終濃度為34μg/ml；

32、s42：將轉化后的細菌接種到步驟s1制得含氯霉素的lb液體或瓊脂培養基上，篩選出能夠耐受氯霉素的陽性克隆，或將培養后的菌涂于載玻片上，在熒光倒置顯微鏡下觀察，若能看到綠色熒光則為陽性克隆。

33、與現有技術相比，采用上述技術方案，氯霉素作為篩選抗生素，能夠有效篩選出轉化成功并攜帶質粒的細菌，通過在培養基中添加氯霉素，使只有成功轉化質粒的細菌才能在含有氯霉素的環境中生長，其他未轉化的細菌將被抑制生長，從而達到篩選陽性克隆的目的，而本實施方式通過優化氯霉素篩選和綠色熒光標記篩選的結合，顯著提高了陽性克隆的篩選準確性和效率，能夠保證篩選出的重組菌株既能夠耐受抗生素，又能夠穩定表達綠色熒光蛋白，從而為后續的細菌動態追蹤和宿主-病原研究提供了可靠的實驗菌株。這不僅提高了實驗的成功率，也確保了最終篩選出的細菌具備穩定的標記特性。

34、本發明要解決的第三個技術問題是提供一種表達綠色熒光的殺香魚假單胞菌重組菌株的應用，以解決現有技術中常規技術存在的無法實時、動態監測細菌在宿主內分布、增殖及感染過程的問題。

35、為克服以上現有技術的缺陷，本發明提供了一種所述表達綠色熒光的殺香魚假單胞菌重組菌株的應用，所述應用包括所述重組菌株在細胞感染模型和動物感染模型中的應用，通過所述重組菌株的綠色熒光標記監測細菌在宿主內的分布、增殖及感染過程。

36、本發明一種表達綠色熒光的殺香魚假單胞菌重組菌株的應用與現有技術相比，具有以下優點：本發明通過將綠色熒光蛋白（gfp）基因導入殺香魚假單胞菌，賦予細菌自發發光的特性，通過熒光顯微鏡可以實時、動態地觀察細菌在宿主細胞和動物體內的生長、定殖及增殖過程，不需要外源底物，能夠在活細胞中自發發光，從而為細菌追蹤研究提供了極為簡便、直觀且無毒的標記方法，現有技術中的感染模型往往難以實時觀察細菌在宿主細胞或動物體內的動態過程，而本發明的應用過程中通過使用綠色熒光標記的殺香魚假單胞菌重組菌株，能夠在細胞感染模型和動物感染模型中實時跟蹤細菌的分布、增殖以及感染進程，克服了現有技術中缺乏動態觀察工具的問題；傳統的感染監測方法通常依賴于外部癥狀或靜態觀察，無法直接觀察細菌的內在行為，而本發明的綠色熒光標記則使得細菌能夠在顯微鏡下清晰可見，且能夠在不同時間點和不同部位對其進行觀察和定量分析，極大提高了實驗監測的效率和精度；且通過本發明構建的綠色熒光標記菌株的應用，確保了熒光標記的穩定性，使得長期觀察成為可能。通過這一標記系統，能夠在整個感染過程中持續監測細菌的生長與擴散，為研究宿主-病原相互作用、致病機制及免疫反應提供了重要支持。

37、在一種可能的實施方式中，所述重組菌株在細胞感染模型中的應用包括：

38、a1：將所述重組菌株接種至含氯霉素的lb培養基中，并在28℃、180?rpm/min條件下培養至對數生長期；

39、a2：將培養后的重組菌懸液感染巨噬細胞j774a.1，孵育并觀察細胞內菌體的分布和增殖情況；

40、a3：通過熒光顯微鏡在不同時間點觀察綠色熒光標記的菌體，分析其在細胞內的定殖與增殖過程。

41、所述重組菌株在動物感染模型中的應用包括：

42、b1：將所述重組菌株接種至含氯霉素的lb液體培養基中培養，獲得所需濃度的菌懸液；

43、b2:將斑馬魚幼魚分別暴露于重組菌株和對照菌懸液中，孵育并監測感染過程；

44、b3：使用熒光顯微鏡觀察斑馬魚體內熒光菌體的分布和增殖情況，定期記錄感染進程中的熒光強度變化。

45、與現有技術相比，采用上述技術方案，在細胞感染模型中，將綠色熒光標記的重組菌株感染巨噬細胞j774a.1后，使用熒光顯微鏡能夠實時觀察細菌在宿主細胞內的定殖與增殖過程，通過綠色熒光蛋白的表達，細菌在細胞內的位置和數量能夠直觀顯示，使得研究人員能夠追蹤感染過程中的細菌動態行為，避免了傳統方法中無法動態監控的問題；在動物感染模型中，將綠色熒光標記的重組菌株暴露于斑馬魚幼魚等物種中，能夠實時觀察熒光標記細菌在魚體內的分布及增殖情況，通過定期記錄熒光強度變化，研究人員可以準確監測細菌感染的進程和宿主反應，為進一步的免疫反應研究提供直觀證據；本發明的應用提供的細菌感染模型中通過綠色熒光標記，能夠為細菌與宿主相互作用的研究提供實時、動態的觀測工具，通過細胞和動物感染模型中的應用，細菌在宿主內的分布、增殖及感染過程可以被精準追蹤，這為深入研究病原菌致病機制、宿主免疫反應及治療策略提供了強有力的技術支持，與現有技術相比，本發明的應用在實時監測細菌感染動態、提高數據精度和實驗可重復性方面具有顯著的優勢。