【】本發明涉及產生血液第viii凝血因子修飾體的離體基因治療用細胞。

背景技術

0、
背景技術：

1、血液第viii凝血因子(以下“fviii”)是擔負止血機構的因子之一，先天性的fviii基因的異常導致血中fviii濃度的缺乏或降低，發生稱為血友病a的止血障礙。對于血友病a的治療很早就使用fviii的血漿來源制劑進行，在現今也至臨床應用基因重組制劑。人fviii是由2332個氨基酸殘基構成的糖蛋白，作為含由19個氨基酸殘基構成的信號肽的由2351個氨基酸殘基構成的前體(在seq?id?no：1顯示其氨基酸序列)，在主要肝臟的細胞中表達之后，經信號肽的切斷或糖鏈修飾等而成為由2332個氨基酸殘基組成的全長(full-length)體。全長體在具有a1-a2-b-a3-c1-c2的結構域結構，a1結構域和a2結構域之間、a2結構域和b結構域之間、b結構域和a3結構域之間，存在各自稱為a1、a2、a3的接頭區域。全長體通過在高爾基體中由弗林蛋白酶(furin)在b結構域的c末端的arg1648和a3接頭區域的n末端的glu1649(seq?id?no：1的氨基酸序列中的1667位和1668位)之間切斷變換為重鏈和輕鏈的雙鏈而成為成熟體，通過從細胞分泌到循環血液中之后，a1接頭區域的c末端的arg372和a2結構域的n末端的ser373之間、a2接頭區域的c末端的arg740和b結構域的n末端的ser741之間、a3接頭區域的c末端的arg1689和a3結構域的n末端的ser1690之間由凝血酶切斷變換為活性體發揮指定的功能。

2、由于血友病a起因于單一基因的遺傳性疾病，被認為適宜于基因治療的目標疾病，因此，近年，精力地進行血友病a的基因治療的研究開發(例如非專利文獻1)。基因治療通過根據其方法，大分為向患者直接施用用于在生物體內表達目的基因的載體的體內(invivo)基因治療，及向從患者取出的細胞導入目的基因而返回患者而在生物體內表達目的基因的離體(ex?vivo)基因治療。

3、作為血友病a的離體基因治療的研究開發，通過進行例如，安全性優良，向宿主細胞基因組有效整合目的基因，使用能經長期穩定的基因表達的慢病毒載體，向從患者取出的細胞導入用于在生物體內產生缺失人fviii的b結構域的fviii修飾體的多核苷酸而返回患者的嘗試(在非專利文獻1中介紹的id：nct03818763)。但是可說，血友病a的離體基因治療的研究開發尚處于發展途上。

4、【現有技術文獻】

5、【非專利文獻】

6、非專利文獻1：柏倉裕志等，對于血友病的基因治療的進步、血栓止血志2021；32(1)：17-25

7、【發明的概要】

8、【發明要解決的課題】

9、本發明旨在提供產生fviii修飾體的新的離體基因治療用細胞。

10、【用于解決課題的手段】

11、本發明的離體基因治療用細胞產生由seq?id?no：1所示的氨基酸序列中的第20～2351位的氨基酸序列構成的人fviii的修飾體(b結構域(第760～1667位的氨基酸序列)被改變，n型糖鏈修飾的asn殘基的個數從n末端側數為4～6個，并且，弗林蛋白酶識認部位的功能缺損的fviii修飾體)。

12、另外，本發明的離體基因治療用細胞是，fviii修飾體是以下的(a)～(c)之任一者。

13、(a)由seq?id?no：2所示的氨基酸序列中的第20～1607位的氨基酸序列構成的蛋白

14、(b)由seq?id?no：2所示的氨基酸序列中的第20～1607位的氨基酸序列中含1個或多個氨基酸殘基的缺失、取代、附加或插入的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白

15、(c)由與seq?id?no：2所示的氨基酸序列中的第20～1607位的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白

16、另外，本發明的離體基因治療用細胞是，fviii修飾體是以下的(a)～(c)之任一者。

17、(a)由seq?id?no：3所示的氨基酸序列中的第20～1652位的氨基酸序列構成的蛋白

18、(b)由seq?id?no：3所示的氨基酸序列中的第20～1652位的氨基酸序列中含1個或多個氨基酸殘基的缺失、取代、附加或插入的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白

19、(c)由與seq?id?no：3所示的氨基酸序列中的第20～1652位的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白

20、另外，本發明的離體基因治療用細胞是，fviii修飾體是以下的(a)～(c)之任一者。

21、(a)由seq?id?no：4所示的氨基酸序列中的第20～1670位的氨基酸序列構成的蛋白

22、(b)由seq?id?no：4所示的氨基酸序列中的第20～1670位的氨基酸序列中含1個或多個氨基酸殘基的缺失、取代、附加或插入的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白

23、(c)由與seq?id?no：4所示的氨基酸序列中的第20～1670位的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白

24、另外，本發明的離體基因治療用細胞是，fviii修飾體是，seq?id?no：1所示的氨基酸序列中的第758位pro殘基被取代為其他氨基酸殘基而成。

25、另外，本發明的離體基因治療用細胞是，其他氨基酸殘基是選自thr殘基、ser殘基、asn殘基、gln殘基的極性無電荷氨基酸殘基。

26、另外，本發明的離體基因治療用細胞是，fviii修飾體是以下的(a)～(c)之任一者。

27、(a)由seq?id?no：5所示的氨基酸序列中的第20～1652位的氨基酸序列構成的蛋白

28、(b)由seq?id?no：5所示的氨基酸序列中的第20～1652位的氨基酸序列中含1個或多個氨基酸殘基的缺失、取代、附加或插入的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白

29、(c)由與seq?id?no：5所示的氨基酸序列中的第20～1652位的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白

30、另外，本發明的離體基因治療用細胞是，fviii修飾體是以下的(a)～(c)之任一者。

31、(a)由seq?id?no：14所示的氨基酸序列中的第20～1652位的氨基酸序列構成的蛋白

32、(b)由seq?id?no：14所示的氨基酸序列中的第20～1652位的氨基酸序列中含1個或多個氨基酸殘基的缺失、取代、附加或插入的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白

33、(c)由與seq?id?no：14所示的氨基酸序列中的第20～1652位的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白另外，本發明的離體基因治療用細胞是，fviii修飾體是以下的(a)～(c)之任一者。

34、(a)由seq?id?no：15所示的氨基酸序列中的第20～1652位的氨基酸序列構成的蛋白

35、(b)由seq?id?no：15所示的氨基酸序列中的第20～1652位的氨基酸序列中含1個或多個氨基酸殘基的缺失、取代、附加或插入的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白

36、(c)由與seq?id?no：15所示的氨基酸序列中的第20～1652位的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白另外，本發明的離體基因治療用細胞是，fviii修飾體是以下的(a)～(c)之任一者。

37、(a)由seq?id?no：16所示的氨基酸序列中的第20～1652位的氨基酸序列構成的蛋白

38、(b)由seq?id?no：16所示的氨基酸序列中的第20～1652位的氨基酸序列中含1個或多個氨基酸殘基的缺失、取代、附加或插入的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白

39、(c)由與seq?id?no：16所示的氨基酸序列中的第20～1652位的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白

40、另外，本發明的離體基因治療用細胞是，細胞是脂肪細胞。

41、另外，本發明的移植用組合物含本發明的離體基因治療用細胞和藥學上容許的載體。另外，本發明的移植用組合物還含細胞外基質成分。

42、另外，本發明的移植用組合物還含血管生成因子。

43、另外，本發明的離體基因治療用細胞的制造方法通過向可移植到離體基因治療的對象的體內的細胞導入搭載至少編碼由seq?id?no：1所示的氨基酸序列中的第20～2351位的氨基酸序列構成的人fviii的修飾體(b結構域(第760～1667位的氨基酸序列)被改變，n型糖鏈修飾的asn殘基的個數從n末端側數為4～6個，并且，弗林蛋白酶識認部位的功能缺損的fviii修飾體))的氨基酸序列的多核苷酸的表達載體。

44、另外，本發明的離體基因治療用細胞的制造方法表達載體是病毒載體。

45、另外，本發明的離體基因治療用細胞的制造方法病毒載體是慢病毒載體。

46、另外，用于制造本發明的離體基因治療用細胞的表達載體搭載至少編碼由seq?idno：1所示的氨基酸序列中的第20～2351位的氨基酸序列構成的人fviii的修飾體(b結構域(第760～1667位的氨基酸序列)被改變，n型糖鏈修飾的asn殘基的個數從n末端側數為4～6個，并且，弗林蛋白酶識認部位的功能缺損的fviii修飾體)的氨基酸序列的多核苷酸而成。

47、另外，本發明的fviii修飾體由seq?id?no：1所示的氨基酸序列中的第20～2351位的氨基酸序列構成的人fviii的修飾體(b結構域(第760～1667位的氨基酸序列)被改變，n型糖鏈修飾的asn殘基的個數從n末端側數為4～6個，并且，弗林蛋白酶識認部位的功能缺損，再者，第758位pro殘基被取代為其他氨基酸殘基而成。

48、另外，本發明的fviii修飾體是，其他氨基酸殘基是選自thr殘基、ser殘基、asn殘基、gln殘基的極性無電荷氨基酸殘基。

49、另外，本發明的多核苷酸至少編碼本發明的fviii修飾體的氨基酸序列。

50、另外，本發明的移植用組合物還含在生物體內產生人vwf和/或其片段的細胞。

51、另外，本發明的細胞在生物體內產生人vwf的片段。

52、另外，本發明的細胞是，人vwf的片段是至少含作為對于fviii的結合部位的d'結構域和d3結構域的片段。

53、另外，本發明的細胞是，人vwf的片段是前體所具有的sp-d1-d2-d'-d3-a1-a2-a3-d4-b1-b2-b3-c1-c2-ck的結構域結構之中，具有sp、d'、d3的各結構域，不具有a2、a3、d4、b1、b2、b3、c1、c2的各結構域，a1結構域最多可有50個n末端側的氨基酸殘基，也可任選具有或不具有d1、d2、ck的各結構域的片段。

54、另外，本發明的細胞是，人vwf的片段是以下的(a)～(c)之任一者。

55、(a)由seq?id?no：29所示的氨基酸序列構成的蛋白

56、(b)由seq?id?no：29所示的氨基酸序列中含1個或多個氨基酸殘基的缺失、取代、附加或插入的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白

57、(c)由與seq?id?no：29所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白

58、另外，本發明的細胞是，人vwf的片段是以下的(a)～(c)之任一者。

59、(a)由seq?id?no：30所示的氨基酸序列構成的蛋白

60、(b)由seq?id?no：30所示的氨基酸序列中含1個或多個氨基酸殘基的缺失、取代、附加或插入的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白

61、(c)由與seq?id?no：30所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白

62、另外，本發明的細胞是，人vwf的片段是以下的(a)～(c)之任一者。

63、(a)由seq?id?no：31所示的氨基酸序列構成的蛋白

64、(b)由seq?id?no：31所示的氨基酸序列中含1個或多個氨基酸殘基的缺失、取代、附加或插入的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白

65、(c)由與seq?id?no：31所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列構成、且與(a)的蛋白具有同等的生物學活性的蛋白另外，本發明的藥劑以用于增加通過向離體基因治療的對象的體內移植本發明的離體基因治療用細胞而產生的fviii修飾體向血中的分泌量的在生物體內產生人vwf和/或其片段的細胞作為有效成分。

66、另外，本發明的移植用組合物含在生物體內產生人vwf和/或其片段的細胞和藥學上容許的載體。

67、另外，本發明的移植用組合物的組包括含本發明的離體基因治療用細胞和藥學上容許的載體的移植用組合物和含在生物體內產生本發明的人vwf和/或其片段的細胞和藥學上容許的載體的移植用組合物。

68、【發明的效果】

69、由本發明可提供產生fviii修飾體的新的離體基因治療用細胞。

70、【附圖的簡單的說明】

71、【圖1】是顯示實施例的實驗a的實驗1中的，5種fviii修飾體(δb、n6、n6δfurin、n5δfurin、n5δfurin(p739t))的b結構域和其前后的氨基酸序列的差異的圖。

72、【圖2】是同、產生n5δfurin(p739t)的慢病毒載體質粒的構成。

73、【圖3】是顯示實施例的實驗a的實驗2中的，制作的5種fviii修飾體基因導入前脂肪細胞中的fviii修飾體基因的平均導入拷貝數的坐標圖。

74、【圖4】是同、顯示制作的5種fviii修飾體基因導入前脂肪細胞的培養液中的fviii抗原量的坐標圖。

75、【圖5】是同、顯示制作的5種fviii修飾體基因導入前脂肪細胞的培養液的fviii活性的坐標圖。

76、【圖6】是同、顯示從制作的5種fviii修飾體基因導入前脂肪細胞分泌到培養液中的fviii修飾體的比活性(抗原量相當的活性)的坐標圖。

77、【圖7】是顯示實施例的實驗a的實驗4中的，向背部皮下移植制作的5種fviii修飾體基因導入前脂肪細胞的小鼠的血中的fviii抗原量的坐標圖。

78、【圖8】是顯示實施例的實驗b的實驗2中的，制作的7種fviii修飾體基因導入前脂肪細胞中的fviii修飾體基因的平均導入拷貝數的坐標圖。

79、【圖9】是同、顯示制作的7種fviii修飾體基因導入前脂肪細胞的培養液中的fviii抗原量的坐標圖。

80、【圖10】是同、顯示制作的7種fviii修飾體基因導入前脂肪細胞的培養液的fviii活性的坐標圖。

81、【圖11】是同、顯示從制作的7種fviii修飾體基因導入前脂肪細胞分泌到培養液中的fviii修飾體的比活性(抗原量相當的活性)的坐標圖。

82、【圖12】是實施例的實驗c的實驗1中的，產生vwf3的慢病毒載體質粒的構成。

83、【圖13】是顯示實施例的實驗c的實驗2中的，將制作的3種人vwf片段基因導入前脂肪細胞與n5δfurin(p739t)基因導入前脂肪細胞在背部皮下混合移植的小鼠的血中的fviii抗原量的坐標圖。

84、【圖14】是顯示實施例的實驗c的實驗3中的，將作為支架原料，使用端膠原，vwf3基因導入前脂肪細胞與n5δfurin(p739t)基因導入前脂肪細胞在背部皮下混合移植的小鼠的血中的fviii抗原量的坐標圖。

85、【圖15】是顯示實施例的實驗c的實驗4中的，將vwf3基因導入前脂肪細胞與n5δfurin(p739t)基因導入前脂肪細胞在背部皮下或鼠腹股溝混合移植的小鼠的血中的fviii抗原量的坐標圖。

86、【圖16】是顯示實施例的實驗c的實驗5中的，將vwf3基因導入前脂肪細胞與n5δfurin(p739t)基因導入前脂肪細胞以3種移植細胞數的比率在鼠腹股溝混合移植的小鼠的血中的fviii抗原量的坐標圖。

技術實現思路