本發明屬于抗體偶聯藥物，尤其涉及一種靶免協同的分步式抗體偶聯藥物及其制備方法與應用。

背景技術：

1、抗體偶聯藥物（antibody–drug?conjugates，adc）由單克隆抗體、連接子與高效細胞毒載荷組成，結合了抗體的靶向識別與小分子毒素的強效殺傷雙重特性。與傳統化療相比，adc能夠借助腫瘤相關抗原實現選擇性遞送，從而提升抑瘤效應并擴大用藥安全窗；相較于單純的單抗藥物，adc所攜帶的細胞毒載荷能夠突破腫瘤微環境屏障，對低抗原表達或具有異質性的腫瘤細胞發揮作用。

2、傳統adc采用單分子一體化設計，即在給藥前已將抗體、連接子和細胞毒載荷預先偶聯為單一藥物分子。然而，這種結構在體循環中容易發生有效載荷的提前脫落，加上抗體可能與正常組織發生非特異性結合，不僅降低了藥物在腫瘤部位的富集與遞送效率，也導致了對健康組織的損傷，引發較高的系統性毒性。此外，抗體本身的免疫激活功能與所偶聯毒素的殺傷效應被固化在同一分子中，無法在時間與空間上實現靈活調控，因而難以與機體免疫系統形成有效協同。

技術實現思路

1、為解決現有adc單一藥物分子存在遞送效率低、系統毒性高以及免疫協同不可控的問題，本發明提供了一種靶免協同的分步式抗體偶聯藥物及其制備方法與應用。

2、本發明的技術方案：

3、一種靶免協同的分步式抗體偶聯藥物，包括分步式給藥的a分子和b分子，所述a分子包括共價連接的單克隆抗體與反式環辛烯基團，所述單克隆抗體為人源化pd-l1?igg1單抗，所述b分子包括共價連接的可裂解連接子ggfg多肽-毒性分子和含有peg8鏈的四嗪基團。

4、進一步的，所述毒性分子為依沙替康衍生物dxd。

5、一種靶免協同的分步式抗體偶聯藥物的制備方法，步驟如下：

6、步驟一、制備a分子：

7、將人源化pd-l1?igg1單抗溶于pbs緩沖液中，加入tcep還原劑，避光反應得到還原后的單抗；將所述還原后的單抗與mal-tco在含有10%dma的pbs緩沖液中震蕩反應，純化后得到a分子；

8、步驟二、制備b分子：

9、將cooh-peg8-cooh與過量tfp混合，在edci作用下通過縮合偶聯反應生成tfp-peg8-tfp；將過量所得tfp-peg8-tfp與metz混合，在diea作用下通過縮合偶聯反應生成tfp-peg8-metz；

10、將過量boc-k與所得tfp-peg8-metz混合，在diea作用下通過縮合偶聯反應生成boc-k-peg8-metz；將所得boc-k-peg8-metz與ggfg-dxd等摩爾比混合，在diea、hobt和edci作用下通過酰胺偶聯，并通過三氟乙酸脫保護，最后生成b分子。

11、進一步的，步驟一所述人源化pd-l1?igg1單抗與tcep還原劑的摩爾比為1:9，所述避光反應的溫度為25℃，反應時間為12h。

12、進一步的，步驟一所述還原后的單抗與mal-tco的摩爾比為1:12，所述震蕩反應的溫度為37℃，震蕩時間為1h。

13、進一步的，步驟二所述cooh-peg8-cooh和tfp的摩爾比為1:4~8；所述tfp-peg8-tfp與metz的摩爾比4~6:1；所述boc-k與tfp-peg8-metz的摩爾比為1.05~1.2:1。

14、進一步的，步驟二所述cooh-peg8-cooh和tfp的摩爾比為1:6；所述tfp-peg8-tfp與metz的摩爾比5:1；所述boc-k與tfp-peg8-metz的摩爾比為1.1:1。

15、一種靶免協同的分步式抗體偶聯藥物在制備抗腫瘤藥物中的應用。

16、進一步的，所述分步式抗體偶聯藥物中a分子為靜脈注射給藥劑型，b分子為靜脈注射或局部灌注給藥劑型，a分子先于b分子給藥且間隔時間為24~48h。

17、進一步的，所述腫瘤為結直腸癌或膀胱癌。

18、本發明公開了一種基于生物正交反應的靶免協同分步式“a+b”策略的抗體偶聯藥物，通過a分子先行預靶向、免疫激活與后續b分子原位快速偶聯的分步給藥順序，實現腫瘤局部高效遞送與安全用藥，同時通過免疫調控促進抗腫瘤免疫反應的啟動和增強，在體內實現時空可控、免疫協同與高效遞送。

19、本發明具有以下由關鍵技術特征直接帶來的有益效果：

20、1.腫瘤局部暴露顯著提升、遞送效率提高：

21、通過先給予含tco的a分子，完成腫瘤特異性預靶向與空間錨定，待a分子在腫瘤部位充分富集后，于預設時間窗（如24–48小時）內給予含tz的b分子，b分子經靜脈或局部灌注給藥，依賴tco–tz的超快生物正交反應在腫瘤原位定點偶聯，可裂解連接子ggfg多肽可在腫瘤微環境特有的組織蛋白酶作用下特異性酶解，實現毒性載荷的精準遞送與釋放，減少體循環中無效分布。在相同載荷劑量條件下，可獲得更高的腫瘤/血液分布比與更充足的病灶內有效暴露。

22、2.?系統毒性降低、治療窗擴大：

23、b分子僅在已被a分子標記的腫瘤區域發生偶聯并內吞釋放，減少非靶組織暴露與游離載荷泄漏。對空腔臟器腫瘤（如膀胱癌）采用局部灌注給藥，進一步降低全身暴露與相關不良反應，從而擴大治療指數、提高用藥安全性與耐受性。

24、3.?免疫協同可控啟動與放大：

25、a分子為抗pd-l1抗體，可在預靶向過程中阻斷pd-1/pd-l1通路并促進腫瘤微環境中巨噬細胞m1型極化；隨后b分子原位釋放dxd引發腫瘤細胞損傷，增強抗腫瘤免疫反應與持續性。

26、4.?降低耐藥風險、提升異質性腫瘤覆蓋：

27、原位偶聯帶來的高局部濃度與穿透，疊加免疫應答的激活，有助于覆蓋低抗原表達或異質性細胞群，降低單一機制耐藥造成的療效波動，提升總體應答的穩定性與持續性。

1.一種靶免協同的分步式抗體偶聯藥物，其特征在于，包括分步式給藥的a分子和b分子，所述a分子包括共價連接的單克隆抗體與反式環辛烯基團，所述單克隆抗體為人源化pd-l1?igg1單抗，所述b分子包括共價連接的可裂解連接子ggfg多肽-毒性分子和含有peg8-k鏈的四嗪基團。

2.根據權利要求1所述一種靶免協同的分步式抗體偶聯藥物，其特征在于，所述毒性分子為依沙替康衍生物dxd。

3.一種如權利要求1或2所述靶免協同的分步式抗體偶聯藥物的制備方法，其特征在于，步驟如下：

4.根據權利要求3所述靶免協同的分步式抗體偶聯藥物的制備方法，其特征在于，步驟一所述人源化pd-l1?igg1單抗與tcep還原劑的摩爾比為1:9，所述避光反應的溫度為25℃，反應時間為12h。

5.根據權利要求3或4所述靶免協同的分步式抗體偶聯藥物的制備方法，其特征在于，步驟一所述還原后的單抗與mal-tco的摩爾比為1:12，所述震蕩反應的溫度為37℃，震蕩時間為1h。

6.根據權利要求5所述靶免協同的分步式抗體偶聯藥物的制備方法，其特征在于，步驟二所述cooh-peg8-cooh和tfp的摩爾比為1:4~8；所述tfp-peg8-tfp與metz的摩爾比4~6:1；所述boc-k與tfp-peg8-metz的摩爾比為1.05~1.2:1。

7.根據權利要求6所述靶免協同的分步式抗體偶聯藥物的制備方法，其特征在于，步驟二所述cooh-peg8-cooh和tfp的摩爾比為1:6；所述tfp-peg8-tfp與metz的摩爾比5:1；所述boc-k與tfp-peg8-metz的摩爾比為1.1:1。

8.一種如權利要求1或2所述靶免協同的分步式抗體偶聯藥物在制備抗腫瘤藥物中的應用。

9.根據權利要求8所述靶免協同的分步式抗體偶聯藥物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于，所述分步式抗體偶聯藥物中a分子為靜脈注射給藥劑型，b分子為靜脈注射或局部灌注給藥劑型，a分子先于b分子給藥且間隔時間為24~48h。

10.根據權利要求8或9所述靶免協同的分步式抗體偶聯藥物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于，所述腫瘤為結直腸癌或膀胱癌。