本發明涉及生物醫藥，尤其涉及細胞保存，具體涉及一種非凍存細胞保存液及其應用。

背景技術：

1、細胞治療的快速發展對離體細胞的質量提出了極高要求，傳統的凍存方法因冰晶損傷和dmso毒性等問題，可能導致細胞活性與功能恢復不佳，且流程復雜，難以滿足即用型（off-the-shelf）細胞產品的需求。hypothermosol?frs作為市場金標準低溫非凍存保存液，通過維持細胞內穩態提供保護，但其保護效果仍有提升空間。

2、相關研究揭示了細胞在低溫應激下的新死亡機制，其中，鐵死亡（ferroptosis）是一種鐵依賴性的脂質過氧化驅動的新型細胞程序性死亡，其是細胞關鍵損傷機制之一。此外，線粒體功能障礙是低溫誘導細胞死亡的另一個核心環節，導致活性氧（ros）大量產生和能量衰竭。

3、另一方面，臨床用于器官靜態冷保存的uw液和htk液，其配方針對器官級別的低溫缺氧損傷設計，但其復雜配方并非為單一細胞懸液的低溫保存而優化。

4、目前，尚無一種保存液能同時整合“抑制鐵死亡”、“多途徑保護線粒體”和“提供器官級代謝支持”三大策略；現有技術也未曾公開將鐵死亡抑制劑與各類線粒體保護劑組合，并協同器官保存液有效成分，用于細胞低溫非凍存保存的方案。

5、針對目前保存液保護效果尚待提高、器官保存液配方復雜對細胞保存不具有針對性等問題，尚未提出有效的解決方法。

技術實現思路

1、本發明的目的是針對現有技術中的至少一個不足，提供一種非凍存細胞保存液及其應用，所述非凍存細胞保存液的基礎液體系經過深度優化，并通過多靶點、多通路協同作用，實現對多種類型細胞更優的低溫保護效果，且配方所有成分明確，無需如perfluorocarbon等載氧劑，有效避免了成分復雜性和潛在不確定性，以解決相關技術中存在的保存液保護效果尚待提高、器官保存液配方復雜對細胞保存不具有針對性等問題。

2、為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：

3、本發明的第一個方面是提供一種非凍存細胞保存液，所述細胞保存液包括基礎液和核心添加劑；其中，核心添加劑包括鐵死亡抑制劑和線粒體保護劑，所述鐵死亡抑制劑的濃度為1~1000?μm，所述線粒體保護劑的濃度為0.1~50?μm。

4、進一步地，所述鐵死亡抑制劑選自去鐵胺（dfo）、去鐵酮（dfp）、鐵抑素-1（ferrostatin-1）、環吡酮胺（ciclopirox?olamine，cpx）、地拉羅司、fer-1、atf3-in-1、mhy1485、轉鐵蛋白中的至少一種；當為ferrostatin-1時，添加濃度為1~100?μm（具體可為10?μm），當為dfo/dfp/地拉羅司時，添加濃度為0.1~2.0?mm（具體可為0.5?mm）。

5、進一步地，所述線粒體保護劑為線粒體靶向芳香族陽離子化合物，選自sul-109、mitoquinone、skulachev?ion中的至少一種；當為sul-109時，使用濃度范圍為1~50?μm（具體可為10~20?μm）；當為mitoquinone時，使用濃度范圍為0.1~10?μm（具體可為1?μm）。

6、進一步地，所述基礎液包括離子體系、緩沖體系、滲透壓調節體系和能量底物。

7、進一步地，所述離子體系包括鉀離子和鈉離子，其中，在非凍存細胞保存液中，鉀離子（k+）的濃度為80~140?mm，優選為100~120?mm；鈉離子（na+）的濃度為10~40?mm，優選為20~30?mm。

8、進一步地，所述緩沖體系包括組氨酸/組氨酸鹽酸鹽緩沖對、磷酸鹽緩沖對中的至少一種，其中，在非凍存細胞保存液中，所述組氨酸/組氨酸鹽酸鹽緩沖對的濃度為15~50mm，優選為25~30?mm；所述磷酸鹽緩沖對的濃度為5~25?mm，優選為15?mm。

9、進一步地，所述滲透壓調節體系包括滲透壓支持劑和滲透壓調節劑，其中，所述細胞保存液的滲透壓采用所述滲透壓調節劑調節至290~320?mosm/l，優選為300~310?mosm/l。

10、進一步地，在非凍存細胞保存液中，所述能量底物的濃度為1~10?mm，所述能量底物包括腺苷、酮戊二酸中的至少一種。

11、進一步地，腺苷的濃度為1~10?mm，作為atp合成前體；酮戊二酸的濃度為1~5?mm，作為三羧酸循環中間物。

12、進一步地，所述滲透壓支持劑包括乳糖醛酸、羥乙基淀粉、海藻糖中的至少一種。其中，在非凍存細胞保存液中，采用乳糖醛酸和/或海藻糖時，所述滲透壓支持劑的濃度為30~120?mm；采用羥乙基淀粉時，所述滲透壓支持劑的用量為0.5~5%?w/v。

13、進一步地，在非凍存細胞保存液中，采用乳糖醛酸時，所述滲透壓支持劑使用濃度為50~120?mm；采用海藻糖時，所述滲透壓支持劑使用濃度為30~100?mm，

14、進一步地，所述滲透壓調節劑包括葡萄糖、蔗糖、甘露醇中的至少一種。

15、進一步地，所述滲透壓調節劑用于防止細胞水腫，提供膠體滲透壓。

16、進一步地，所述基礎液還包括膜穩定劑；其中，在非凍存細胞保存液中，所述膜穩定劑的濃度為1~15?mm，所述膜穩定劑包括還原型谷胱甘肽、n-乙酰半胱氨酸、鎂離子中的至少一種，其中，當為還原型谷胱甘肽時，其濃度為1~5?mm，作為內源性抗氧化劑；當n-乙酰半胱氨酸時，其濃度為1~50?mm，優選為5mm，作為抗氧化劑；當為鎂離子時，其濃度為5~15mm，作為重要的酶輔因子。

17、進一步地，所述緩沖體系還包括hepes緩沖劑，其中，所述hepes緩沖劑的濃度為10~20?mm。

18、本發明的第二個方面是保護一種細胞和/或組織保存方法，其采用如第一個方面所述的非凍存細胞保存液進行細胞和/或組織樣本的低溫保存。

19、進一步地，所述細胞樣本來源于動物及人類原代細胞、干細胞、腫瘤細胞，所述組織樣本來源于動物及人類組織樣本，具體地，細胞樣本包括t細胞、干細胞和肝細胞。

20、進一步地，所述t細胞為原代人t細胞，所述干細胞為人間充質干細胞（hmscs）。

21、進一步地，所述非凍存細胞保存液的保存溫度為2℃?~8℃，且在4℃保存細胞7天后，細胞存活率大于85%。

22、本發明的第三個方面是提供一種如第一個方面所述非凍存細胞保存液或如第二個方面所述的細胞和/或組織保存方法的應用，所述應用包括以下應用中的至少一種：在制備細胞產品儲存制劑中的應用、在制備細胞產品運輸制劑中的應用、在制備細胞樣品中的應用、在制備組織產品儲存制劑中的應用、在制備組織產品運輸制劑中的應用、在制備組織樣品中的應用。

23、本發明采用以上技術方案，與現有技術相比，具有如下技術效果：

24、本發明的非凍存細胞保存液摒棄簡單的等滲鹽水，針對細胞保存專門設計，采用高鉀低鈉的細胞內液型配方，從根本上降低了細胞在低溫下的離子泵負荷和水腫風險，為細胞提供了一個“休眠”般的穩定內環境，對基礎體系進行優化，其同時適用于各類組織的保存；并通過組氨酸緩沖對的引入，使細胞保存液的緩沖能力遠超常規細胞保存液（如hypothermosol），甚至媲美器官保存液（如htk），能長時間維持ph穩定；優化的基礎液為細胞提供了基本穩態，鐵死亡抑制劑和線粒體靶向保護劑則在此基礎上精準打擊關鍵損傷通路，提供疊加增益效果；通過模擬細胞內液離子環境、并整合鐵死亡抑制、線粒體靶向保護及強化代謝支持等多重機制，顯著提升不同細胞在低溫保存后的存活率與功能；且本發明的細胞保存液配方所有成分明確，無需如perfluorocarbon等載氧劑，避免了成分復雜性和潛在不確定性，更利于標準化生產和質量控制，在細胞治療產品的運輸與臨時儲存中具有重要的應用意義和價值。