本發(fā)明涉及精子冷凍保存，具體涉及一種高效精子凍干保存液及其制備方法。
背景技術(shù)：
1、隨著不育癥治療的發(fā)展特別是人工授精和體外受精技術(shù)的推廣，精子冷凍保存技術(shù)在臨床上應(yīng)用越來(lái)越廣泛，尤其是在男女不育、癌癥患者需要在治療前保存精子和動(dòng)物品種改良方面精子保存技術(shù)發(fā)揮了重要作用；早期的人工授精技術(shù)主要依賴新鮮精子，但在實(shí)踐中許多情況下需要儲(chǔ)存精子以便在未來(lái)使用，精子的長(zhǎng)期保存需求強(qiáng)烈。傳統(tǒng)的冷凍保存方法難以確保精子的生物活性，冰晶的形成和細(xì)胞內(nèi)水分的膨脹會(huì)導(dǎo)致精子膜破裂和結(jié)構(gòu)受損，因此需要有效的精子保護(hù)液減少冷凍過(guò)程中對(duì)精子的傷害，保護(hù)精子在低溫或凍結(jié)過(guò)程中不受到損傷，從而使其在未來(lái)能夠成功解凍并保持活性，精子保存液在精子保存技術(shù)中至關(guān)重要。
2、目前常用的精子冷凍保護(hù)劑包括甘油、蛋黃、枸櫞酸鈉，然而單一的精子冷凍保護(hù)劑效果并不理想，往往需要結(jié)合多種成分以提高精子在冷凍和復(fù)蘇過(guò)程中的存活率和活力；公開(kāi)號(hào)為cn117965433a的中國(guó)專利提供了一種提高體外精子存活率和活性的方法、產(chǎn)品及應(yīng)用，其使用一種人工合成的具有蛋白質(zhì)qrich2的n端氨基酸序列的蛋白質(zhì)與現(xiàn)有的精液保存液混合的方法可以顯著提高凍存精液的活性，可以有效的長(zhǎng)期保存精子，但是其保存條件需求高，且不能在室溫環(huán)境下運(yùn)輸和保存；公開(kāi)號(hào)為cn106818712a的中國(guó)專利公開(kāi)了一種精子干燥液以及精子保存的方法，可以在室溫環(huán)境下保存精子，但是不能長(zhǎng)期保存，且使用該精子干燥液保存的精子存活率和活性受限。
3、針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種解決方案。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于：提供一種高效精子凍干保存液及其制備方法，其適用于冷凍干燥法可以使精子在室溫環(huán)境下運(yùn)輸和保存，且保存的精子存活率和活性良好。
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種高效精子凍干保存液由以下百分比成分組成：0.06％-0.1％氨基三羥甲基甲烷、0.02-0.04％檸檬酸、1-2％卵磷脂、2-5％維生素c、8-15％海藻糖、3-5％甘露糖醇、10-20％聚乙烯吡咯烷酮、0.3-0.4％edta二鈉、3-5％胎牛血清、20-25％二甲基亞砜、20-25％磷酸鹽緩沖溶液和0.05-0.1％干細(xì)胞因子；
3、其中干細(xì)胞因子的制備方法包括以下步驟：
4、a1：紫外線消毒操作臺(tái)30分鐘，打開(kāi)水浴鍋加熱至37℃，隨后配置培養(yǎng)基44.5mldmem+5ml胎牛血清+0.5ml雙抗，用鑷子從液氮中快速取出間質(zhì)干細(xì)胞后馬上置于水浴鍋中解凍融化；
5、a2：將間質(zhì)干細(xì)胞懸液吸裝到15ml離心管，加入6ml?dmem(+/+)，配平并離心，1000rpm/min，共離心3分鐘，離心完成后棄去上清液，加入1ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將重懸細(xì)胞均勻鋪在60mm培養(yǎng)皿內(nèi)，將皿上下左右均勻晃動(dòng)，隨后將培養(yǎng)皿放置于5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
6、a3：顯微鏡觀察細(xì)胞密度達(dá)85％時(shí)棄去原培養(yǎng)基后，應(yīng)用磷酸鹽緩沖溶液洗滌細(xì)胞2次，使用移液槍完全移去培養(yǎng)基后使用5ml?9％胰蛋白酶消化間質(zhì)干細(xì)胞，使間質(zhì)干細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿底部在培養(yǎng)皿中加入5ml培養(yǎng)基終止消化，使用移液槍吹吸培養(yǎng)基和胰蛋白酶混合物使間質(zhì)干細(xì)胞完全混勻制成間質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞懸液；
7、a4：將間質(zhì)干細(xì)胞懸液吸裝到15ml離心管，加入6ml?dmem(+/+)，配平并離心，1000rpm/min，共離心3分鐘，離心完成后棄去上清液，加入1ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將重懸細(xì)胞均勻鋪在60mm培養(yǎng)皿內(nèi)，將皿上下左右均勻晃動(dòng)，隨后將培養(yǎng)皿放置于5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
8、a5：顯微鏡觀察細(xì)胞密度達(dá)85％時(shí)棄去原培養(yǎng)基后，應(yīng)用磷酸鹽緩沖溶液洗滌細(xì)胞2次，洗滌完成后加入無(wú)血清培養(yǎng)基，隨后將培養(yǎng)皿放置于5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；
9、a6：收集培養(yǎng)完成后的無(wú)血清培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入5％甘露糖醇，混勻置于凍干機(jī)上凍干12h，凍干完成后得到干細(xì)胞因子。
10、進(jìn)一步的，步驟a1中所述的雙抗為氨芐青霉素和鏈霉素混合抗生素，其中氨芐青霉素和鏈霉素的質(zhì)量比為1：1；步驟b6中所述的無(wú)血清培養(yǎng)基與5％甘露糖醇的質(zhì)量比例為20：1。
11、進(jìn)一步的，一種高效精子凍干保存液的制備方法包括以下步驟：
12、b1：紫外線消毒操作臺(tái)30分鐘，打開(kāi)水浴鍋溫度設(shè)置為25-30℃，隨后將氨基三羥甲基甲烷、聚乙烯吡咯烷酮和edta二鈉和二甲基亞砜加入無(wú)酶離心管中水浴加熱，水浴加熱期間輕輕晃動(dòng)離心管至完全混勻得到凍干保存液前置液a；
13、b2：將檸檬酸、卵磷脂、維生素c和甘露糖醇混合溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，隨后將混合物轉(zhuǎn)移至無(wú)酶離心管中，水浴鍋溫度設(shè)置為30-35℃，水浴加熱，水浴加熱期間輕輕晃動(dòng)離心管至完全混勻得到凍干保存液前置液b；
14、b3：將凍干保存液前置液a和凍干保存液前置液b混合，隨后加入胎牛血清和干細(xì)胞因子，使用移液槍吹吸混合均勻得到精子凍干保存液。
15、進(jìn)一步的，所述聚乙烯吡咯烷酮為水溶性聚乙烯吡咯烷酮，分子量為40；所述檸檬酸為白色檸檬酸粉末，規(guī)格為200目；所述卵磷脂為黃色蛋黃卵磷脂粉末，規(guī)格為200目；所述維生素c為白色水溶性左旋抗壞血酸粉末，規(guī)格為200目；
16、綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果為，本發(fā)明可以在凍干過(guò)程中保護(hù)精子免受損傷，減少凍存過(guò)程中的精子凋亡增強(qiáng)精子對(duì)凍存環(huán)境的適應(yīng)性幫助精子在解凍后恢復(fù)活性和功能，能夠有效提高精子在冷凍干燥及復(fù)蘇后的存活率和活力，同時(shí)降低冷凍引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，可以改善凍存精子的質(zhì)量，提高凍存精子的活力和受精能力，且適用于冷凍干燥法可以使精子在室溫環(huán)境下運(yùn)輸和保存。
1.一種高效精子凍干保存液，其特征在于，由以下百分比成分組成：0.06％-0.1％氨基三羥甲基甲烷、0.02-0.04％檸檬酸、1-2％卵磷脂、2-5％維生素c、8-15％海藻糖、3-5％甘露糖醇、10-20％聚乙烯吡咯烷酮、0.3-0.4％edta二鈉、3-5％胎牛血清、20-25％二甲基亞砜、20-25％磷酸鹽緩沖溶液和0.05-0.1％干細(xì)胞因子；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效精子凍干保存液，其特征在于，步驟a1中所述的雙抗為氨芐青霉素和鏈霉素混合抗生素，其中氨芐青霉素和鏈霉素的質(zhì)量比為1：1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效精子凍干保存液，其特征在于，步驟b6中所述的無(wú)血清培養(yǎng)基與5％甘露糖醇的質(zhì)量比例為20：1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效精子凍干保存液，其特征在于，所述聚乙烯吡咯烷酮為水溶性聚乙烯吡咯烷酮，分子量為40。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效精子凍干保存液，其特征在于，所述檸檬酸為白色檸檬酸粉末，規(guī)格為200目。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效精子凍干保存液，其特征在于，所述卵磷脂為黃色蛋黃卵磷脂粉末，規(guī)格為200目。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效精子凍干保存液，其特征在于，所述維生素c為白色水溶性左旋抗壞血酸粉末，規(guī)格為200目。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效精子凍干保存液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：